PUMA通過(guò)減少FASN泛素化促進(jìn)人類透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的脂質(zhì)積累和腫瘤進(jìn)展

   p53上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)因子（PUMA）傳統(tǒng)上被認(rèn)為可在多種癌癥中促進(jìn)細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)化療療效，但由于透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（ccRCC）對(duì)化療具有耐藥性，其在ccRCC中的作用尚不明確。該研究通過(guò)分析公共數(shù)據(jù)集、臨床組織樣本和細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PUMA在ccRCC中具有新型致癌作用，這與其已知的凋亡功能不同。PUMA的異常高表達(dá)與臨床分期呈正相關(guān)，且預(yù)示預(yù)后不良。值得注意的是，PUMA在ccRCC中的作用似乎獨(dú)立于凋亡過(guò)程，相反，它通過(guò)涉及關(guān)鍵代謝調(diào)節(jié)因子 —— 脂肪酸合成酶（FASN）的機(jī)制促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和脂質(zhì)積累。具體而言，PUMA的N44-102 氨基酸序列（不同于先前研究的BH3結(jié)構(gòu)域）是其與FASN相互作用的關(guān)鍵。機(jī)制上，PUMA通過(guò)與泛素特異性蛋白酶 15（USP15）結(jié)合來(lái)穩(wěn)定 FASN，減少FASN的泛素化和降解，從而形成PUMA-USP15-FASN軸。這些發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了PUMA在癌癥生物學(xué)中的既定認(rèn)知。此外，敲低PUMA可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，并增強(qiáng)ccRCC腫瘤對(duì)代謝抑制的敏感性。這些結(jié)果表明，PUMA是一種新型代謝調(diào)節(jié)因子，可能成為ccRCC的治療靶點(diǎn)。聯(lián)合抑制PUMA和FASN進(jìn)一步支持了靶向這一代謝軸的治療潛力。這篇文章于2025年6月發(fā)表在《cell death & disease》期刊上，IF:9.6。

研究技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、PUMA 在 ccRCC 中的高表達(dá)與臨床分期呈正相關(guān)

    作者從 GEPIA 和 UCSC Xena 數(shù)據(jù)中心獲取了 PUMA 的 mRNA 數(shù)據(jù)。GEPIA 的基因點(diǎn)圖分析顯示，與正常組織相比，PUMA 在 11 種癌癥類型中均呈高表達(dá)（見(jiàn)圖 1A），包括 ccRCC（即腎透明細(xì)胞癌，KIRC）?；?span> 534 例 ccRCC 患者和 72 對(duì)配對(duì)組織樣本（腫瘤及相應(yīng)的正常腎組織）的數(shù)據(jù)，小提琴圖和折線圖也顯示 ccRCC 腫瘤中 PUMA mRNA 水平較高（圖 1B、C）。在 TCGA 數(shù)據(jù)集中，將 534 例 ccRCC 樣本中 RNA 水平高于中位數(shù)（7.5085）的定義為高表達(dá)，低于中位數(shù)的定義為低表達(dá)（圖 1D）。部分 Kaplan-Meier 曲線分析表明，PUMA 高表達(dá)可能與總生存期縮短相關(guān)（圖 1D 和 S1A）。通過(guò)比較 ccRCC 腫瘤組織與正常腎組織的曲線下面積（AUC）值，發(fā)現(xiàn) PUMA 的表達(dá)水平具有高特異性和臨床診斷價(jià)值（圖 1E）。小提琴圖證實(shí)，PUMA 高表達(dá)與 ccRCC 的晚期腫瘤分期和癌癥分級(jí)相關(guān)（圖 1F-H）。單因素 Cox 分析顯示，PUMA mRNA 水平與多種臨床病理參數(shù)顯著相關(guān)，包括 TNM 分期。然而，多因素 Cox 分析表明，PUMA 并非獨(dú)立的預(yù)后標(biāo)志物（p=0.194）。

圖 1：PUMA 在 ccRCC 中的高表達(dá)與臨床分期呈正相關(guān)。

    為進(jìn)一步驗(yàn)證作者的發(fā)現(xiàn)，作者檢查了 25 對(duì) ccRCC 患者的臨床組織樣本。實(shí)時(shí)定量 PCR（qPCR）分析結(jié)果顯示，腫瘤組織中 PUMA mRNA 表達(dá)較正常組織顯著增加（圖 1I）。免疫組織化學(xué)分析再次證實(shí)了腫瘤組織中 PUMA 的高表達(dá)（圖 1J）。此外，Western blot 分析顯示，在 22 對(duì)組織樣本中，腫瘤組織的 PUMA 蛋白表達(dá)高于正常組織（圖 1K，L）。另外，與人類腎細(xì)胞（HK-2）相比，人類 ccRCC 細(xì)胞（A-498、ACHN、Caki-1）的 PUMA 蛋白和 mRNA 表達(dá)均較高（圖 1M，N）。值得注意的是，786-O 細(xì)胞的 PUMA mRNA 表達(dá)顯著高于 HK-2，而 786-O 與 OS-RC-2 之間的蛋白水平無(wú)顯著差異（p>0.05）。A-498 作為典型的 ccRCC 細(xì)胞系，Caki-1 代表轉(zhuǎn)移性 ccRCC。這兩種細(xì)胞系在 VHL 和 p53 上表現(xiàn)出不同的突變模式。作者選擇它們?cè)诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行比較，以強(qiáng)調(diào)結(jié)果的普遍性?？傊?，基于公共數(shù)據(jù)、臨床組織和細(xì)胞系的所有評(píng)估均證實(shí)，PUMA 在 ccRCC 中高表達(dá)，且與患者的臨床分期較高相關(guān)。

2、PUMA 在 ccRCC 中的新型致癌作用與凋亡無(wú)關(guān)

    為了研究 ccRCC 中高表達(dá) PUMA 的生物學(xué)作用，作者將攜帶 PUMA 特異性短發(fā)夾 RNA（shPUMA）的慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 A-498 和 Caki-1 細(xì)胞中，以建立穩(wěn)定的 PUMA 敲低細(xì)胞系。通過(guò) Western blotting 和 qPCR 驗(yàn)證，敲低效率超過(guò) 70%。對(duì)照組（CN）使用空白慢病毒質(zhì)粒生成。測(cè)量關(guān)鍵凋亡通路分子以評(píng)估 PUMA 表達(dá)與凋亡的相關(guān)性，包括全長(zhǎng) PARP、Bcl-2、caspases-3、-6 和 - 7，以及線粒體凋亡標(biāo)志物如細(xì)胞色素 C。Western blot 結(jié)果顯示，在對(duì)照組和 shPUMA 組之間，無(wú)論是全細(xì)胞裂解物還是細(xì)胞質(zhì) / 線粒體組分，凋亡標(biāo)志物的表達(dá)或激活均無(wú)顯著差異。此外，細(xì)胞色素 C 保留在線粒體中，進(jìn)一步支持沒(méi)有線粒體凋亡激活。對(duì)多種凋亡標(biāo)志物蛋白的比較證實(shí)，在作者的模型中，PUMA 水平與凋亡活性沒(méi)有直接相關(guān)性。

    為了研究 PUMA 是否影響 ccRCC 的進(jìn)展，作者對(duì) PUMA 敲低組和對(duì)照組進(jìn)行了集落形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞活力測(cè)試。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，PUMA 敲低組在 A-498 和 Caki-1 細(xì)胞系中的細(xì)胞增殖率和集落形成能力顯著降低（圖 2A-C）。Transwell 實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，PUMA 敲低組的細(xì)胞遷移和侵襲能力減弱（圖 2D，E）?？傊?span>PUMA 的敲低與 A-498 和 Caki-1 細(xì)胞系惡性進(jìn)展的顯著降低相關(guān)。

圖 2：PUMA 在 ccRCC 中的新型致癌作用與細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)。

    ccRCC 的惡性進(jìn)展由代謝重編程驅(qū)動(dòng)，其特征是細(xì)胞質(zhì)中糖原和脂滴的大量積累。如圖 S1F 所示，PUMA 與 ccRCC 中的葡萄糖積累沒(méi)有直接關(guān)聯(lián)，但作者觀察到其與脂滴呈正相關(guān)。與對(duì)照組相比，PUMA 敲低組在 A-498 和 Caki-1 細(xì)胞系中的脂滴含量均降低。結(jié)果通過(guò)油紅 O（ORO）染色和定量分析呈現(xiàn)（圖 2F，G）。與對(duì)照組相比，PUMA 敲低組中 A-498 和 Caki-1 細(xì)胞的甘油三酯和總膽固醇均降低（圖 2H），這在 ccRCC 的背景下呈現(xiàn)出獨(dú)特的模式。相反，在 PUMA 過(guò)表達(dá)組中，細(xì)胞增殖、脂滴、甘油三酯和總膽固醇均增加。這些發(fā)現(xiàn)暗示 PUMA 在促進(jìn) ccRCC 進(jìn)展和脂質(zhì)積累中起作用。

    為了證實(shí)作者之前的體外發(fā)現(xiàn)，作者在裸鼠中創(chuàng)建了皮下和轉(zhuǎn)移性腫瘤模型。在 PUMA 敲低組和對(duì)照組中均進(jìn)行了皮下和尾靜脈注射。大體腫瘤圖像和生長(zhǎng)曲線顯示，與對(duì)照組相比，PUMA 敲低組的腫瘤大小、重量和生長(zhǎng)速率均降低（圖 2I-K）。免疫組織化學(xué)顯示，敲低組的 PUMA 表達(dá)顯著降低，各組之間的凋亡標(biāo)志物無(wú)差異。H&E 和 ORO 染色一致顯示，PUMA 敲低組的組織切片惡性程度較低，脂質(zhì)積累低于對(duì)照組（圖 2L）。在肝臟大體圖中，與對(duì)照組相比，PUMA 敲低組的肝轉(zhuǎn)移灶更少（圖 2M）?？偟膩?lái)說(shuō)，作者進(jìn)一步鞏固了之前的發(fā)現(xiàn)（圖 2A-H），即 PUMA 促進(jìn) ccRCC 中的腫瘤進(jìn)展和脂質(zhì)積累，且獨(dú)立于其在凋亡中的作用。

    近期研究強(qiáng)調(diào)線粒體凋亡通路的激活是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)因素。這提出了 PUMA 可能通過(guò)亞致死信號(hào)促進(jìn) ccRCC 侵襲性腫瘤行為的可能性。按照之前的方法，作者評(píng)估了線粒體和核組分中的 EndoG 水平。與對(duì)照組相比，shPUMA 組中未觀察到 EndoG 的顯著核轉(zhuǎn)位或激活。同樣，通過(guò) ICAD（CAD 的抑制劑）和 γH2AX（DNA 損傷標(biāo)志物）分析 CAD 活性，顯示 shPUMA 組和對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。這些結(jié)果表明，通過(guò) EndoG 或 CAD 的亞致死信號(hào)不參與觀察到的腫瘤表型。然后，作者使用 CRISPR-Cas9 生成 ENDOG/CAD 和 BAK/BAX 雙敲除（DKO）細(xì)胞，通過(guò) Western blotting 驗(yàn)證敲除效率。對(duì)這些 DKO 細(xì)胞中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的評(píng)估顯示，shPUMA 組和對(duì)照組之間無(wú)表型差異。因此，與 PUMA 相關(guān)的侵襲性生長(zhǎng)表型獨(dú)立于通過(guò) EndoG/CAD 的亞致死信號(hào)或其通過(guò) BAX/BAK 的促凋亡功能，表明 PUMA 通過(guò)其他機(jī)制發(fā)揮作用。

3、直接相互作用：FASN 是 PUMA 功能的關(guān)鍵

    為了探索 PUMA 在 ccRCC 中的亞細(xì)胞定位，作者使用細(xì)胞質(zhì) - 核分級(jí)分離和線粒體分離實(shí)驗(yàn)分析了其在不同細(xì)胞區(qū)室中的表達(dá)。Western blotting 顯示，PUMA 主要定位于 HK-2、A-498、Caki-1 和 786-O 細(xì)胞系的線粒體中。免疫熒光成像證實(shí)了細(xì)胞質(zhì) PUMA 的定位及其與線粒體標(biāo)志物的共定位，與之前的研究一致。這些發(fā)現(xiàn)表明，鑒于線粒體在腫瘤代謝重編程（尤其是脂質(zhì)代謝）中的關(guān)鍵作用，PUMA 可能參與 ccRCC 的脂質(zhì)代謝。

    為了進(jìn)一步探索 PUMA 在 ccRCC 內(nèi)的分子相互作用，作者使用 PUMA 抗體進(jìn)行免疫沉淀（IP）實(shí)驗(yàn)，從全細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)裂解物中分離蛋白質(zhì)。全細(xì)胞蛋白分析顯示，與 IgG 抗體相比，PUMA 抗體下拉了 320 種蛋白質(zhì)，表明 PUMA 與不同的蛋白質(zhì)池相互作用?；?span> IP 和 MS 結(jié)果，作者進(jìn)行了基因本體論（GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路分析。結(jié)果表明，PUMA 相關(guān)分子在代謝通路和脂質(zhì)代謝通路中富集。為了提高檢測(cè)靈敏度，進(jìn)行了細(xì)胞質(zhì)分級(jí)分離以從細(xì)胞質(zhì)中分離蛋白質(zhì)。用 PUMA 抗體進(jìn)行免疫沉淀從細(xì)胞質(zhì)組分中獲得了 222 種蛋白質(zhì)，而用 IgG 下拉了 139 種蛋白質(zhì)。通過(guò)將全細(xì)胞 IP、細(xì)胞質(zhì) IP 及其各自的 IgG 對(duì)照的數(shù)據(jù)集相交，確定了 43 個(gè)潛在靶點(diǎn)。將細(xì)胞質(zhì) IP 數(shù)據(jù)集與脂質(zhì)代謝數(shù)據(jù)進(jìn)一步相交，作者發(fā)現(xiàn)了 28 個(gè)與脂質(zhì)代謝相關(guān)的分子。值得注意的是，這 28 個(gè)分子是全細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)數(shù)據(jù)集中 43 個(gè)靶點(diǎn)的一部分，驗(yàn)證了它們?cè)谥|(zhì)代謝通路中的相關(guān)性。在作者的分析中，FASN 在與脂質(zhì)代謝通路相關(guān)的分子中綜合得分最高。鑒于線粒體為脂肪酸合成提供乙酰輔酶 A 和檸檬酸，而 FASN 利用乙酰輔酶 A 作為其脂肪酸生物合成的底物，因此提出 FASN 是參與脂質(zhì)代謝的 PUMA 的關(guān)鍵下游靶點(diǎn)是合理的。

    作者進(jìn)一步研究了 ccRCC 中與脂質(zhì)代謝相關(guān)的 PUMA 分子相互作用?；?span> IP 和 MS 結(jié)果，作者重疊了三個(gè)數(shù)據(jù)集：細(xì)胞質(zhì) IgG、細(xì)胞質(zhì) IP 和脂肪酸生物合成。該分析確定 FASN（脂肪酸生物合成中的關(guān)鍵酶）是僅有的與 PUMA 相互作用的分子（圖 3A）。這一發(fā)現(xiàn)與圖 S4G 一致，表明 FASN 是 PUMA 在脂質(zhì)代謝中作用的關(guān)鍵。內(nèi)源性和外源性 Co-IP 實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 A-498、Caki-1 和 HEK293T 中 PUMA-FASN 的相互作用（圖 3B，C）。此外，BAX/BAK DKO 細(xì)胞中的 Co-IP 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這種相互作用，表明 PUMA 與 FASN 的結(jié)合獨(dú)立于其促凋亡功能。共聚焦成像證實(shí) FASN 主要定位于細(xì)胞質(zhì)（圖 3D），并與 PUMA 共定位，尤其是在線粒體區(qū)域。這些結(jié)果突顯了 FASN 在 PUMA 介導(dǎo)的 ccRCC 脂質(zhì)代謝中的重要作用。

圖 3：直接相互作用：FASN 是 PUMA 功能的關(guān)鍵。

    接下來(lái)，作者使用 FRET 分析和 Co-IP 測(cè)定驗(yàn)證了 PUMA-FASN 相互作用。作者構(gòu)建了 Clover2-PUMA 和 mRuby2-FASN 質(zhì)粒，通過(guò)分別用一對(duì) FRET 熒光團(tuán) Clover（供體）和 mRuby2（受體）標(biāo)記 PUMA 和 FASN。FRET 測(cè)定結(jié)果證實(shí)了 PUMA 和 FASN 之間的直接相互作用（圖 3E，F）。作者生成了一系列 PUMA 缺失構(gòu)建體（HA-PUMA ΔBH3、HA-PUMA ΔMLS、HA-PUMA ΔBH3/MLS、HA-PUMA-N43、HA-PUMA-N44–102、HA-PUMA-N103–140），并將它們與 FLAG-FASN 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到 HEK293T 細(xì)胞中（圖 3G）。Co-IP 結(jié)果顯示，PUMA 的 N44-102 和 N103-140 區(qū)域?qū)ζ渑c FASN 的相互作用至關(guān)重要（圖 3H，I）。這不同于先前公認(rèn)的 BH3 結(jié)構(gòu)域，后者被認(rèn)為是主要的相互作用基序。最近的一篇論文提出了另一種觀點(diǎn)，認(rèn)為 PUMA 的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可能超出傳統(tǒng)的 BH3 基序，其亞細(xì)胞定位可能受其表達(dá)水平和結(jié)合結(jié)構(gòu)域的影響。這與作者的發(fā)現(xiàn)一致，即 PUMA 在其 BH3 結(jié)構(gòu)域之外與 FASN 相互作用，表明參與 PUMA 在脂質(zhì)代謝中作用的替代結(jié)合位點(diǎn)。總之，作者發(fā)現(xiàn) ccRCC 中 PUMA 和 FASN 之間存在蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用，PUMA 的 N 端 44-140 序列在這種相互作用中起關(guān)鍵作用。

4、PUMA 介導(dǎo) FASN 表達(dá)以驅(qū)動(dòng) ccRCC 進(jìn)展并促進(jìn)脂質(zhì)積累

    FASN 在脂肪酸生物合成中至關(guān)重要，并與包括 ccRCC 在內(nèi)的各種癌癥的腫瘤發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)。作者進(jìn)行了 Transwell 實(shí)驗(yàn)以探索 PUMA 和 FASN 之間的調(diào)節(jié)關(guān)系，發(fā)現(xiàn) FASN 的補(bǔ)充幾乎恢復(fù)了 PUMA 敲低組的遷移和侵襲能力（圖 4A，B）。在細(xì)胞活力測(cè)定中觀察到類似結(jié)果（圖 4C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，PUMA 調(diào)節(jié) FASN 的致癌活性，從而促進(jìn) ccRCC 中的腫瘤增殖和遷移。同樣，ORO 染色和甘油三酯及膽固醇的測(cè)量顯示，FASN 的補(bǔ)充幾乎恢復(fù)了 PUMA 敲低組的脂滴形成和脂質(zhì)代謝物水平（圖 4D-F）。這些結(jié)果與 Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致（圖 4A，B），進(jìn)一步支持 PUMA 通過(guò) FASN 促進(jìn) ccRCC 中脂質(zhì)代謝和惡性進(jìn)展的作用。

圖 4：PUMA 介導(dǎo) FASN 表達(dá)以驅(qū)動(dòng) ccRCC 進(jìn)展并促進(jìn)脂質(zhì)積累。

    為了進(jìn)一步研究 PUMA-FASN 相互作用的功能相關(guān)性，作者在 PUMA 敲低細(xì)胞中過(guò)表達(dá)全長(zhǎng) PUMA 和截短構(gòu)建體（N44-102 和 N103-140）。Transwell 實(shí)驗(yàn)顯示，PUMA 的補(bǔ)充恢復(fù)了細(xì)胞遷移，N44-102 構(gòu)建體產(chǎn)生了類似的效果。細(xì)胞增殖和 ORO 染色測(cè)定再次證實(shí)，全長(zhǎng) PUMA 恢復(fù)了增殖能力和脂滴水平，添加 N44-102 基序達(dá)到了類似的結(jié)果。這些結(jié)果進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了 PUMA 的 N44-102 基序在與 FASN 直接相互作用中的關(guān)鍵作用，從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和脂質(zhì)積累。

5、PUMA 通過(guò)泛素 - 蛋白酶體途徑增強(qiáng) FASN 穩(wěn)定性和表達(dá)

    作者進(jìn)一步探索揭示 PUMA 和 FASN 之間相互作用的機(jī)制。基于不同臨床分期（I-II 和 III-IV）的 10 對(duì)臨床組織樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。研究結(jié)果顯示，隨著惡性程度的升高，PUMA 和 FASN 的染色均增強(qiáng)（圖 5A）。重要的是，觀察到 PUMA 和 FASN 染色強(qiáng)度之間存在正相關(guān)（見(jiàn)圖 5A）。隨后，在 12 對(duì) ccRCC 臨床組織樣本中檢查了蛋白質(zhì)表達(dá)。觀察到 FASN 和 PUMA 的蛋白質(zhì)表達(dá)之間存在正相關(guān)，與正常組相比，PUMA 敲低組中 FASN 表達(dá)顯著降低（圖 5B，C）。在體內(nèi)，FASN 表達(dá)隨著 PUMA 敲低而相應(yīng)降低（圖 5D）。將研究擴(kuò)展到 ccRCC 細(xì)胞系，Western blotting 顯示 FASN 和 PUMA 的蛋白質(zhì)水平協(xié)同升高（圖 5E）。FASN 的蛋白質(zhì)和 mRNA 表達(dá)水平在 ccRCC 細(xì)胞系中高度升高，類似于 PUMA。隨后的 Western blot 分析表明，與對(duì)照組相比，PUMA 敲低組中 FASN 蛋白表達(dá)降低，而過(guò)表達(dá) PUMA 細(xì)胞系中 FASN 蛋白表達(dá)增加（圖 5F，G 和 S6C，D）。在 qPCR 分析中，無(wú)論 PUMA 表達(dá)如何，FASN mRNA 水平均未觀察到顯著變化（圖 5G 和 S6D）。這些發(fā)現(xiàn)與之前的研究一致，表明 FASN 表達(dá)主要在翻譯后水平而不是 mRNA 水平受到調(diào)節(jié)。最后，與對(duì)照組相比，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性測(cè)定顯示 PUMA 敲低組中 FASN 的半衰期較短（圖 5H，I）。

圖 5：PUMA 通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑增強(qiáng) FASN 穩(wěn)定性和表達(dá)。

    最近的研究報(bào)道了細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)與脂質(zhì)代謝之間的相關(guān)性，表明 FASN 過(guò)表達(dá)也可能與細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)。為了研究 PUMA 是否獨(dú)立于其促凋亡活性調(diào)節(jié) FASN，作者評(píng)估了 BAX/BAK DKO 細(xì)胞中對(duì)照組和 PUMA 過(guò)表達(dá)組的 FASN 蛋白水平。Western blot 分析顯示，PUMA 過(guò)表達(dá)仍然導(dǎo)致 BAX/BAK DKO 細(xì)胞中 FASN 表達(dá)增加，與 BAX 和 BAK 完整的細(xì)胞中的觀察結(jié)果一致。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)，PUMA 調(diào)節(jié) FASN 獨(dú)立于其促凋亡功能。

    為了研究參與 FASN 蛋白降解的途徑，作者用兩種經(jīng)典的蛋白質(zhì)降解途徑抑制劑處理 ccRCC 細(xì)胞系：MG132（泛素 - 蛋白酶體抑制劑，10μM）和氯喹（自噬 - 溶酶體抑制劑，25μM）。時(shí)間梯度 Western blotting 顯示，MG132 處理增加了 FASN 蛋白水平（圖 5J 和 S6F，G）。PUMA 敲低組和對(duì)照組用cycloheximide（CHX，蛋白質(zhì)合成抑制劑，25μM）處理。12 小時(shí)后，每組中的一半細(xì)胞用 MG132 處理，其余一半不接受額外處理。如圖 S6H 所示，添加 MG132 導(dǎo)致兩組中 FASN 蛋白表達(dá)水平增加。為了進(jìn)一步研究 PUMA 如何調(diào)節(jié) FASN，作者進(jìn)行了泛素化 IP 測(cè)定，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，PUMA 敲低組中 FASN 泛素化增加（圖 5K，L）。作者建立了穩(wěn)定敲低 PUMA 的 HEK293T 細(xì)胞系，通過(guò) Western blotting 證實(shí)。在 HEK293T 細(xì)胞中，PUMA 過(guò)表達(dá)降低了 FASN 泛素化水平（圖 5L）。這些結(jié)果表明，PUMA 通過(guò)泛素 - 蛋白酶體途徑調(diào)節(jié) FASN 的泛素化并調(diào)控其蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。

6、PUMA-USP15-FASN 軸及其與 FASN 抑制劑的協(xié)同效應(yīng)

    由于 PUMA 缺乏催化活性結(jié)構(gòu)域，可能需要一種中間蛋白來(lái)促進(jìn)其對(duì) FASN 泛素化的調(diào)節(jié)?；仡欀暗?span> MS 分析結(jié)果，作者發(fā)現(xiàn)去泛素酶 USP7 和 USP15 可能與 PUMA 相互作用（圖 6A）。然而，關(guān)于 EIF3H 作為去泛素化酶的理解和應(yīng)用仍不完整，需要進(jìn)一步全面探索。在 HEK293T 細(xì)胞中，作者進(jìn)行了以下組合的共轉(zhuǎn)染：（1）FLAG-PUMA 和 HA-USP7 質(zhì)粒，以及 FLAG-PUMA 和 HA-USP15 質(zhì)粒；（2）FLAG-FASN 和 HA-USP7 質(zhì)粒，以及 FLAG-FASN 和 HA-USP15 質(zhì)粒。Co-IP 結(jié)果表明，USP15 是 PUMA 和 FASN 之間的調(diào)節(jié)銜接蛋白（圖 6B）。

圖 6：PUMA-USP15-FASN 軸及其與 FASN 抑制劑的協(xié)同作用。

   通過(guò)免疫沉淀進(jìn)一步驗(yàn)證了 PUMA-USP15-FASN 軸。在 PUMA 敲低細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，與 USP15 共免疫沉淀的 FASN 量減少，而 PUMA 過(guò)表達(dá)增加了與 USP15 相關(guān)的 FASN 水平（圖 6C）。在 Caki-1 和 A-498 細(xì)胞系中觀察到類似結(jié)果，表明 PUMA 敲低組中 USP15 免疫純化的 FASN 水平降低（圖 6D）。此外，HEK293T 細(xì)胞中 USP15 過(guò)表達(dá)降低了 FASN 的泛素化水平，增強(qiáng)了其免疫純化（圖 6E，F）。USP15 抑制后，FASN 的蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低，與 PUMA 表達(dá)水平無(wú)關(guān)（圖 6G）。綜合這些結(jié)果，作者證實(shí) PUMA 通過(guò) USP15 調(diào)節(jié) FASN 的泛素化，這鞏固了 PUMA-USP15-FASN 軸存在的合理性。

   先前的研究已將 PUMA 確立為抑制 ccRCC 惡性進(jìn)展的有前景的治療靶點(diǎn)。然而，靶向藥物的不良反應(yīng)和脫靶效應(yīng)是當(dāng)前 ccRCC 治療中的難題。鑒于 FASN 抑制劑單獨(dú)的臨床療效有限，越來(lái)越多的建議主張將其與其他靶點(diǎn)聯(lián)合使用。因此，作者深入研究了 PUMA 和 FASN 抑制劑的聯(lián)合療效。作者評(píng)估了四個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組中腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)情況：對(duì)照組、PUMA 敲低組、用 C75（一種 FASN 抑制劑，35μM）處理的對(duì)照組，以及用 C75 處理的 PUMA 敲低組。PUMA 敲低組和用 C75 處理的對(duì)照組中腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制，而同時(shí)接受 C75 和 PUMA 敲低的組中效果更顯著（圖 6H）。具體而言，PUMA-KD 組（與對(duì)照組相比）的抑制效率顯著高于 PUMA 和 FASN 聯(lián)合抑制組（與單獨(dú) FASN 抑制組相比）。使用 CLZ-8（一種 PUMA 抑制劑）和 C75 評(píng)估它們?cè)?span> A-498 和 Caki-1 細(xì)胞中的聯(lián)合效應(yīng)。使用 Combenefit 軟件分析兩種抑制劑之間的相互作用。Combenefit 的分析顯示 CLZ-8 和 C75 之間存在明顯的協(xié)同效應(yīng)（圖 6I）。此外，劑量 - 反應(yīng)分析表明，增加 CLZ-8 濃度允許減少 C75 劑量，同時(shí)保持療效。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了 PUMA 和 FASN 抑制的協(xié)同潛力，表明它們的聯(lián)合治療是臨床中 ccRCC 的有前途的治療方法。

   因此，作者進(jìn)行了額外的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證敲低 PUMA 對(duì)裸鼠中抑制劑 C75 的增強(qiáng)作用。分組與體外實(shí)驗(yàn)一致（圖 6H）。用 C75 處理的兩組（包括圖 6H 中的對(duì)照組和 PUMA 敲低組）每周腹腔注射 20mg/kg，而沒(méi)有 C75 的對(duì)照組和 PUMA 敲低組腹腔注射等體積的生理鹽水，共 36 天。結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)一致（圖 6H）。與任何單一干預(yù)相比，PUMA 敲低組和 C75 聯(lián)合使用顯著減緩了腫瘤生長(zhǎng)（圖 6K）。這些發(fā)現(xiàn)表明，PUMA 在更廣泛的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中起作用，FASN 是關(guān)鍵但非僅有的組成部分。此外，PUMA 和 FASN 抑制的協(xié)同潛力支持它們的聯(lián)合治療作為臨床中 ccRCC 的有前途的治療策略。

7、ccRCC 中 PUMA-USP15-FASN 軸的機(jī)制模型

    總之，作者提出了 PUMA-USP15-FASN 軸的機(jī)制模型（圖 7A）。該模型揭示，ccRCC 中 PUMA 的異常高表達(dá)調(diào)節(jié) FASN，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累和腫瘤的惡性進(jìn)展。作者的分子研究揭示了一種新的調(diào)節(jié)機(jī)制，其中 PUMA 通過(guò) USP15 作為銜接蛋白與 FASN 結(jié)合，形成 PUMA-USP15-FASN 軸。該軸的建立有助于揭示 ccRCC 中的腫瘤進(jìn)展和脂質(zhì)代謝重編程。此外，與單獨(dú)干預(yù)相比，PUMA-FASN 抑制的聯(lián)合調(diào)節(jié)可以更有效地轉(zhuǎn)化為實(shí)際臨床應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

   Luo, Q., Wang, Q., Shi, J. et al. PUMA reduces FASN ubiquitination to promote lipid accumulation and tumor progression in human clear cell renal cell carcinoma. Cell Death Dis 16, 460 (2025). 

實(shí)驗(yàn)方法：

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染、Transwell 實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞活力測(cè)定、集落形成實(shí)驗(yàn)

常規(guī)分子實(shí)驗(yàn)：WB、RT-qPCR、免疫組織化學(xué)與免疫熒光、油紅 O（ORO）染色、PAS反應(yīng)、甘油三酯和總膽固醇測(cè)定、免疫沉淀（IP）與質(zhì)譜（MS）分析、共免疫沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）分析

動(dòng)物模型及病理分析：體內(nèi)異種移植模型