FBXO31介導的OGT泛素化維持O-GlcNAcylation穩(wěn)態(tài)以抑制子宮內(nèi)膜惡性腫瘤

         蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化是一種與細胞代謝可塑性密切相關的翻譯后修飾。在包括子宮內(nèi)膜癌（EC）在內(nèi)的多種癌癥中均觀察到異常的O-GlcNAc糖基化現(xiàn)象。然而，關于EC中O-GlcNAc糖基化穩(wěn)態(tài)失調(diào)的臨床特征及其分子機制研究仍不完善。本研究通過包含219例腫瘤組織的中國患者隊列分析發(fā)現(xiàn)，O-GlcNAc糖基化水平與EC組織學分級呈正相關，該結果在癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)集中得到驗證。在患者來源的子宮內(nèi)膜上皮類器官中，提高O-GlcNAc糖基化水平可促進增殖和干細胞樣特性，而降低O-GlcNAc糖基化則會抑制子宮內(nèi)膜癌類器官的生長。CRISPR篩選和生化分析表明，腫瘤抑制因子FBXO31通過泛素化修飾O-GlcNAc轉移酶OGT來調(diào)控EC中的O-GlcNAc糖基化穩(wěn)態(tài)。下調(diào)O-GlcNAc糖基化可有效抑制小鼠模型中EC腫瘤的形成。本研究系統(tǒng)論證了O-GlcNAc糖基化可作為晚期低分化EC病例的分層標志物和治療靶點。該研究于2025年2月發(fā)表在《Nature Communications》，IF：14.7。

技術路線：

主要研究結果：

1.子宮內(nèi)膜癌中O-GlcNAc糖基化水平升高與組織學分級及不良預后呈正相關

         為探究EC組織中O-GlcNAc糖基化的整體水平，我們采用上海芯超生物科技有限公司提供的EC組織芯片（包含23例癌旁和31例癌變子宮內(nèi)膜標本），使用抗O-GlcNAc單克隆抗體RL2（該抗體以大鼠肝細胞核孔復合體-核纖層組分為免疫原制備，已通過多種應用場景驗證其跨物種檢測O-GlcNAc糖基化的廣泛適用性24,27–34）以及OGT、OGA抗體進行免疫組化分析（圖1a）。結果顯示，相較于對照組，EC組織上皮細胞中O-GlcNAc糖基化水平和OGT表達量均顯著升高（圖1b-e），這與既往研究結論一致24。然而，OGA在癌旁與癌變子宮內(nèi)膜組織中的表達未見顯著差異。

         為深入探究O-GlcNAc糖基化水平與子宮內(nèi)膜癌臨床特征的關系，我們將研究隊列擴展至中南大學湘雅醫(yī)院婦科接受子宮切除術的219例EC患者（圖1a）。對石蠟包埋的EC組織切片進行免疫組化分析，通過RL2抗體染色半定量評估各樣本O-GlcNAc糖基化水平并進行患者分組。具體而言，由兩名獨立評估人員根據(jù)陽性染色腫瘤細胞比例（評分0-4分：0=陰性；1=1-25%；2=26-50%；3=51-75%；4=76-100%）和染色強度（評分0-3分：0=陰性；1=弱；2=中等；3=強）進行量化評分，并經(jīng)病理學家復核確認。最終以比例評分與強度評分的乘積作為各樣本的免疫組化總分35-37。根據(jù)IHC評分將患者分為高O-GlcNAc糖基化組（High-RL2：8-12分）和低O-GlcNAc糖基化組（Low-RL2：0-6分）。這種高低分組狀態(tài)與EC組織學分級、FIGO分期及遠處轉移顯著相關（附表1）。值得注意的是，組織學分級更高的EC患者組織中O-GlcNAc糖基化水平顯著升高（圖1f），且G3級患者中高O-GlcNAc糖基化病例明顯富集（圖1g）。進一步統(tǒng)計分析顯示，O-GlcNAc糖基化水平與腫瘤組織學分級（Goodman-Kruskal gamma統(tǒng)計量p≤0.0001；雙側gamma-knife γ=0.473）及遠處轉移（Goodman-Kruskal gamma統(tǒng)計量p=0.003；雙側gamma-knife γ=1）均呈正相關。Kaplan-Meier分析表明，高O-GlcNAc糖基化組患者的無進展生存期（PFS）和總生存期（OS）均顯著短于低O-GlcNAc糖基化組（圖1h,i）。單因素分析顯示O-GlcNAc糖基化水平與年齡、FIGO分期、肌層浸潤深度均為PFS的顯著相關因素。后續(xù)對所有顯著性變量（p<0.05）進行多因素Cox回歸分析，最終確定O-GlcNAc糖基化水平與年齡是EC患者臨床結局的獨立預測因子（附表2）。

圖1.子宮內(nèi)膜癌中O-GlcNAc糖基化水平升高與組織學分級及不良預后呈正相關

2.基于TCGA子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)集計算的虛擬O-GlcNAc指數(shù)與腫瘤組織學分級及生存期相關

         為驗證本研究中發(fā)現(xiàn)的關聯(lián)性，我們利用TCGA UCEC數(shù)據(jù)集進行驗證分析。僅基于OGT或OGA表達的總體生存期（OS）Kaplan-Meier分析未顯示統(tǒng)計學差異，提示單純OGT或OGA的mRNA豐度不足以反映O-GlcNAc糖基化水平，EC中OGT蛋白量可能受翻譯或翻譯后調(diào)控。為更準確評估O-GlcNAc糖基化水平，我們根據(jù)RL2免疫組化評分選取40例高O-GlcNAc糖基化和15例低O-GlcNAc糖基化冷凍EC樣本進行RNA測序?；蚣患治觯?span>GSEA）顯示，高O-GlcNAc糖基化組中上皮-間質(zhì)轉化（EMT）和血管生成相關基因顯著富集。進一步計算各基因轉錄水平與O-GlcNAc糖基化免疫組化評分的Pearson相關系數(shù)（r），篩選r>0.3的前1000個基因構成O-GlcNAc糖基化相關基因集?；虮倔w（GO）分析表明這些基因在纖毛相關生物過程中高度富集，該結果與O-GlcNAc糖基化水平與EC組織學分級的關聯(lián)性一致，因為多纖毛形成是子宮內(nèi)膜上皮細胞分化的標志。

         我們隨后基于該基因集表達矩陣，采用R語言機器學習算法構建數(shù)學模型，計算TCGA UCEC隊列中每個樣本的虛擬O-GlcNAc指數(shù)。TCGA數(shù)據(jù)集中計算的O-GlcNAc指數(shù)與組織學分級和FIGO分期顯著相關（圖2a），這鞏固了本EC隊列的觀察結果。晚期G3級患者組的O-GlcNAc指數(shù)顯著高于G1或G2級組（圖2b）；同樣，FIGO II-IV期患者的指數(shù)也較I期患者顯著升高（圖2c）。值得注意的是，分析O-GlcNAc指數(shù)與EC分子分型的關系發(fā)現(xiàn)，在所有EC病例中臨床預后最差的拷貝數(shù)高型患者39，其O-GlcNAc指數(shù)顯著高于其他分子亞型（圖2d）。該指數(shù)還隨年齡增長而升高，而年齡是EC患者臨床結局的獨立預測因子（圖2e）。我們進一步以O-GlcNAc指數(shù)中位值為界，將TCGA隊列中的EC患者分為高/低O-GlcNAc糖基化組，高O-GlcNAc糖基化組患者的無進展間期（PFI）和總生存期（OS）均顯著縮短（圖2f,g）。綜上所述，無論是在本研究的EC患者隊列還是TCGA UCEC數(shù)據(jù)集中，子宮內(nèi)膜癌組織中升高的O-GlcNAc糖基化水平均與更晚期的組織學分級及更差的臨床預后顯著相關。

圖2.基于TCGA子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)集計算的虛擬O-GlcNAc指數(shù)與腫瘤組織學分級及生存期相關

3.抑制OGA升高O-GlcNAc糖基化促進非癌性子宮內(nèi)膜上皮類器官增殖與干性

         已有小分子抑制劑可調(diào)控O-GlcNAc循環(huán)酶OGT和OGA活性，被廣泛用于體外和體內(nèi)研究O-GlcNAc糖基化功能42-52。我們使用OGA抑制劑Thiamet-G（TMG）處理EE-Os以提升細胞O-GlcNAc糖基化水平（圖3a,b）。TMG處理增強了EE-Os的集落形成能力和類器官生長（圖3c,d），并增加每個EE-O中有絲分裂細胞數(shù)量（圖3e,f）。乙?；?span>α-微管蛋白（Ac-tubulin）和PAEP分別是子宮內(nèi)膜多纖毛上皮細胞和分泌細胞的分化標志物41。TMG處理導致PAEP陽性細胞和Ac-tubulin標記的多纖毛細胞數(shù)量減少（圖3g,h），提示O-GlcNAc糖基化水平升高引起EE-Os中子宮內(nèi)膜細胞去分化。我們進一步檢測了子宮內(nèi)膜干性標志物（SSEA-1、SOX9、ALDH1、OCT4、CD133和SOX2）表達水平。與PAEP mRNA水平下降相反，所有干性標志物表達均上調(diào)（圖3i）。鑒于GSEA提示高O-GlcNAc糖基化可能促進EMT和血管生成，我們還檢測了TMG處理EE-Os中這兩個過程相關基因的表達。上皮標志物E-cadherin和ZO-1表達無變化，但6個間質(zhì)標志物中的FN-1、Snail1、TWIST2和MMP1表達升高；血管生成相關基因中，PDGFA和VEGFC表達上調(diào)，其余基因表達未變或下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明，O-GlcNAc糖基化升高可促進子宮內(nèi)膜上皮細胞去分化，并不同程度地增強其EMT和血管生成能力。為深入解析TMG處理對EE-Os中不同細胞亞型的影響，我們對對照組和TMG處理的EE-Os進行單細胞RNA測序分析（圖3j）。根據(jù)已知標志物的特異性表達38,53，細胞被聚類分為六種主要亞型：前纖毛細胞型、纖毛細胞型、干細胞型、增殖型、O-GlcNAc相關干樣細胞型和炎癥型。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)了一種O-GlcNAc相關干樣細胞亞型，該亞型細胞表現(xiàn)出激活的干細胞多能性調(diào)控信號通路及O-聚糖生物合成通路。TMG處理導致EE-Os中纖毛和前纖毛細胞亞型比例顯著降低，同時增殖型和O-GlcNAc相關干樣細胞亞型比例增加（圖3k），這一結果證實O-GlcNAc糖基化水平上調(diào)可促進子宮內(nèi)膜上皮細胞的增殖和干性。

         作為對比，我們使用OGT抑制劑OSMI-1處理EE-Os，分析降低O-GlcNAc糖基化對非癌性子宮內(nèi)膜上皮細胞的影響。OSMI-1處理僅輕微影響EE-Os生長，且類器官形成數(shù)量無顯著變化。TUNEL染色顯示OSMI-1處理的EE-Os未出現(xiàn)明顯凋亡，多纖毛分化細胞數(shù)量保持穩(wěn)定。對OSMI-1處理的EE-Os中干性、EMT和血管生成標志基因的檢測也未發(fā)現(xiàn)一致性改變，這些結果表明OGT抑制對EE-Os細胞的影響較為有限。

圖3.抑制OGA升高O-GlcNAc糖基化促進非癌性子宮內(nèi)膜上皮類器官增殖與干性

4.抑制OGT降低O-GlcNAc糖基化可阻礙子宮內(nèi)膜癌類器官增殖并誘導分化與細胞死亡

         為探究降低O-GlcNAc糖基化能否抑制EC-Os中腫瘤細胞生長，我們采用OGT化學抑制劑OSMI-1處理EC-Os（圖4a,b）。OSMI-1的加入顯著阻礙了EC-Os的形成與生長。與同期對照組相比，OSMI-1處理組中大量EC-Os出現(xiàn)細胞暗化裂解現(xiàn)象，導致類器官數(shù)量和體積均顯著減少（圖4a-d）。TUNEL染色顯示OSMI-1處理的EC-Os中存在大量凋亡細胞（圖4e）。對形態(tài)相對正常的殘留EC-Os進行免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)OSMI-1處理后，磷酸化組蛋白H3（PH3）標記的有絲分裂細胞幾乎不可見（圖4f,g）。同時，這些EC-Os中PAEP陽性分泌細胞和Ac-tubulin標記的多纖毛細胞比例均增加（圖4h,i），表明OSMI-1處理促進了細胞分化。與此一致，OSMI-1處理的EC-Os中干性標志物（SSEA-1、SOX9、ALDH1、OCT4、CD133和SOX2）表達顯著下調(diào)，而分化標志物PAEP表達上調(diào)（圖4j）。所有間質(zhì)標志物（FN-1、Vimentin、Snail1、TWIST2、TGFB1和MMP1）表達均下降（圖4k），多數(shù)血管生成標志物在OSMI-1處理的EC-Os中也呈現(xiàn)表達降低（圖4l）。

         為確認OSMI-1對EC-Os的作用具有靶向特異性，我們通過短發(fā)夾RNA（shRNA）直接敲低OGT表達并重復實驗。與OSMI-1處理結果一致，shRNA敲低OGT同樣能下調(diào)O-GlcNAc糖基化水平，并顯著抑制EC-Os的形成與生長。OGT敲低后的EC-Os細胞凋亡增加，殘留細胞多呈現(xiàn)多纖毛化，且分化標志物PAEP表達上調(diào)、干性基因表達下調(diào)。這些結果表明，不同方式誘導的O-GlcNAc糖基化水平降低均可導致EC-Os中腫瘤細胞的生長受限、分化增強和凋亡增加。

         我們同樣采用OGA抑制劑TMG處理EC-Os以驗證其促瘤效應。TMG處理顯著增加EC-Os的數(shù)量和體積，干性基因（如SOX9、ALDH1、CD133和SOX2）表達上調(diào)而分化標志物PAEP下調(diào)。此外，所有間質(zhì)標志物及多數(shù)血管生成基因在TMG處理的EC-Os中表達均升高，提示OGA抑制可進一步加劇惡性表型。

         子宮內(nèi)膜類器官的OGT/OGA抑制劑實驗顯示，EE-Os對O-GlcNAc糖基化下調(diào)的敏感性低于EC-Os。為驗證此現(xiàn)象，我們選取2例O-GlcNAc糖基化水平較高的EC患者來源EC-Os和2例非EC患者EE-Os進行3D細胞活力檢測。除OSMI-1外，還加入其衍生物OSMI-454。結果顯示，TMG處理促進EE-Os和EC-Os增殖，而OSMI-1或OSMI-4抑制OGT時，EC-Os的活力降低程度顯著大于對照EE-Os（圖4m）。這些發(fā)現(xiàn)表明，OGT抑制劑能有效抑制體外腫瘤類器官的擴增，尤其對固有高O-GlcNAc糖基化水平的腫瘤效果顯著。

圖4.抑制OGT降低O-GlcNAc糖基化可阻礙子宮內(nèi)膜癌類器官增殖并誘導分化與細胞死亡

5.全基因組篩選維持O-GlcNAc糖基化穩(wěn)態(tài)的腫瘤抑制因子

         為鑒定調(diào)控內(nèi)皮細胞O-GlcNAc糖基化穩(wěn)態(tài)的關鍵因子，我們開展了全基因組CRISPR-Cas9敲除篩選實驗。將靶向19,050個基因（每個基因6條sgRNA）的慢病毒單導RNA（sgRNA）文庫與1000條非靶向?qū)φ?span>sgRNA以0.3的感染復數(shù)（MOI）共轉染293T細胞，確保每個細胞僅表達單一sgRNA。使用抗O-GlcNAc抗體RL2染色后，通過流式分選（FACS）分離RL2熒光信號最強的5%細胞群，并對該群體中的sgRNA進行深度測序（圖5a、b）?；?span>sgRNA豐度數(shù)據(jù)，采用MAGeCK55計算各基因的穩(wěn)健秩和聚合（RRA）評分進行排序，RRA評分越小表明基因重要性越高。通過文獻回顧我們收集了已知能影響細胞O-GlcNAc糖基化穩(wěn)態(tài)的調(diào)控因子56–71。負向調(diào)控O-GlcNAc糖基化的基因（如TSC2、SIRT1和TP53）RRA評分較小，在基因列表中較正向調(diào)控因子更集中于前半部分（圖5c）。對篩選獲得的1038個高置信度基因（p<0.05）進行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)這些基因顯著富集于ECM-受體相互作用、產(chǎn)熱作用、組氨酸代謝、癌癥中的蛋白聚糖以及青少年發(fā)病的成人型糖尿病等通路（圖5d）。

         為進一步明確影響內(nèi)皮細胞（EC）組織中O-GlcNAc糖基化水平的關鍵調(diào)控因子，我們將全基因組篩選獲得的1038個陽性候選基因與526個EC潛在抑癌基因72,73進行交叉比對，最終鑒定出18個重疊基因（圖5e），包括ACVR1C、AGTR1、CADM2、PRKAA1、CDKN1C、CMTM3、DIRAS3、SIK1、EPHB4、GATA5、ITGAV、KLF10、MAP3K8、PLA2G2A、PTPN11、RNASEL、SPARCL1及FBXO31。基于TCGA UCEC數(shù)據(jù)集對上述基因進行Kaplan-Meier生存分析，發(fā)現(xiàn)僅FBXO31在EC組織中表達下調(diào)且與患者不良預后顯著相關。為此，我們通過CRISPR技術構建了FBXO31敲除（FBXO31-KO）的293T細胞系。RL2抗體免疫熒光染色證實，FBXO31-KO細胞中O-GlcNAc糖基化水平顯著升高（圖5f）。

圖5.全基因組篩選維持O-GlcNAc糖基化穩(wěn)態(tài)的腫瘤抑制因子

6.FBXO31通過結合并泛素化OGT限制O-GlcNAc糖基化水平

         FBXO31作為SCF泛素E3連接酶復合物的底物識別組分，可調(diào)控多種蛋白的降解（參考文獻74-79）。據(jù)此我們推測，FBXO31可能通過直接結合并泛素化O-GlcNAc轉移酶OGT來調(diào)控O-GlcNAc糖基化水平。為驗證FBXO31與OGT的相互作用，我們首先采用細菌純化的GST-OGT蛋白與表達GFP-FBXO31的293T細胞裂解液進行pull-down實驗。Western blot結果顯示，相較于GST對照，GST-OGT能顯著下拉GFP-FBXO31（圖6a）。進一步在過表達Flag-OGT和GFP-FBXO31的293T細胞中進行免疫共沉淀實驗，發(fā)現(xiàn)GFP-FBXO31可與Flag-OGT共沉淀，且當加入蛋白酶體抑制劑MG132后，免疫沉淀物中Flag-OGT和GFP-FBXO31的含量均顯著增加（圖6b）。

         為評估FBXO31與OGT的相互作用是否調(diào)控OGT蛋白穩(wěn)態(tài)，我們在293T細胞中轉染梯度濃度的GFP-FBXO31質(zhì)粒，通過Western blot檢測OGT及O-GlcNAc糖基化水平。結果顯示，OGT蛋白量與細胞O-GlcNAc糖基化水平均與GFP-FBXO31表達量呈負相關（圖6c）。值得注意的是，蛋白酶體抑制劑MG132可顯著逆轉GFP-FBXO31過表達導致的OGT下調(diào)，表明FBXO31通過泛素-蛋白酶體降解途徑調(diào)控OGT水平（圖6d）。

         為證實FBXO31能否誘導OGT泛素化，我們在過表達GFP-FBXO31和HA-泛素的293T細胞裂解液中免疫沉淀OGT，Western blot檢測到GFP-FBXO31存在時OGT呈現(xiàn)強烈多聚泛素化信號（圖6e）。進一步通過體外實驗驗證：從表達HA標記的Skp1、Cul1和Roc1（含或不含FBXO31）的293T細胞中，用HA磁珠親和純化SCF復合物，與細菌純化的E1、E2、泛素及His-OGT共孵育。結果顯示含FBXO31的SCF復合物可直接催化His-OGT發(fā)生多聚泛素化（圖6f）。鑒于SCF復合物中Skp1通過F-box結構域招募F-box蛋白，我們構建了FBXO31的F-box缺失突變體（FBXO31ΔF）。在293T細胞中，GFP-FBXO31與HA-泛素共表達可誘導免疫沉淀的Flag-OGT發(fā)生顯著多聚泛素化，而GFP-FBXO31ΔF突變體則顯著削弱該效應（圖6g），證實FBXO31需依賴完整SCF復合物發(fā)揮E3泛素連接酶活性。

         在FBXO31-KO的293T細胞中，OGT蛋白及O-GlcNAc糖基化水平均顯著升高（圖6h）。蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX處理實驗顯示，FBXO31缺失使OGT半衰期明顯延長（圖6i），表明FBXO31通過調(diào)控OGT降解維持其細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

         為驗證該調(diào)控機制在子宮內(nèi)膜癌細胞中的普適性，我們在Ishikawa細胞中過表達GFP-FBXO31。免疫熒光顯示GFP-FBXO31陽性細胞中OGT及RL2檢測的O-GlcNAc信號均顯著降低。CRISPR構建的FBXO31-KO Ishikawa細胞中，OGT與O-GlcNAc水平明顯上調(diào)。雖然內(nèi)源性FBXO31與OGT相互作用較弱，但外源過表達的GFP-FBXO31與Flag-OGT在Ishikawa細胞中可明確共沉淀。在過表達GFP-FBXO31和HA-泛素的Ishikawa細胞中，免疫沉淀OGT檢測到顯著的多聚泛素化信號，證實FBXO31在子宮內(nèi)膜癌細胞中同樣通過泛素-蛋白酶體途徑調(diào)控OGT。

         已知O-GlcNAc糖基化可通過穩(wěn)定YAP、β-catenin和c-Myc等蛋白促進腫瘤進展。在野生型與FBXO31-KO Ishikawa細胞中，雖然YAP和β-catenin變化不明顯，但c-Myc水平顯著升高且該效應依賴OGT——敲低OGT可使c-Myc恢復至野生型水平。免疫沉淀實驗證實c-Myc在子宮內(nèi)膜癌細胞中存在O-GlcNAc修飾，且FBXO31缺失細胞中O-GlcNAc修飾的c-Myc顯著增加。這些結果揭示c-Myc是FBXO31-OGT調(diào)控軸下游的關鍵效應分子，其O-GlcNAc修飾促進子宮內(nèi)膜癌進展。

圖6 FBXO31通過結合并泛素化OGT限制O-GlcNAc糖基化水平

7.FBXO31缺失通過增加O-GlcNAc糖基化促進子宮內(nèi)膜類器官生長

         為探究FBXO31調(diào)控O-GlcNAc糖基化穩(wěn)態(tài)的臨床意義，我們利用子宮內(nèi)膜癌隊列組織標本進行分析。免疫組化（IHC）顯示，相較于正常子宮內(nèi)膜組織，EC組織中FBXO31蛋白水平顯著下調(diào)，且常與O-GlcNAc糖基化水平呈負相關模式（圖7a, b）?；?span>IHC信號半定量分析發(fā)現(xiàn)，低O-GlcNAc糖基化EC組的FBXO31蛋白水平明顯高于高O-GlcNAc糖基化組（圖7c）。進一步分析TCGA UCEC隊列中虛擬O-GlcNAc指數(shù)與FBXO31表達水平的關系，觀察到顯著負相關性（圖7d）。Western blot結果顯示，與正常子宮內(nèi)膜類器官（EE-Os）相比，EC類器官（EC-Os）中FBXO31蛋白水平降低伴隨OGT水平升高（圖7e），提示EC組織中O-GlcNAc糖基化升高源于OGT上調(diào)。將EC隊列病例分為FBXO31低表達組與高表達組，發(fā)現(xiàn)FBXO31表達與O-GlcNAc糖基化狀態(tài)及組織學分級顯著相關（附表3）。

圖7 FBXO31缺失通過增加O-GlcNAc糖基化促進子宮內(nèi)膜類器官生長

8.OGT化學抑制抑制小鼠模型子宮內(nèi)膜腫瘤生長

         體外實驗證實O-GlcNAc糖基化對子宮內(nèi)膜癌細胞的影響后，我們推測靶向OGT降低O-GlcNAc水平可能成為潛在治療策略。為此，我們在Ishikawa細胞異種移植小鼠模型中評估了OGT抑制劑OSMI-1的抗腫瘤效果。皮下移植Ishikawa細胞10天后，將荷瘤小鼠隨機分為三組，分別通過腹腔注射給予DMSO（溶劑對照）、TMG（20 mg/kg/天）或OSMI-1（10 mg/kg/天）（圖8a）。與對照組相比，TMG處理促進腫瘤生長并縮短生存期，而OSMI-1處理顯著減小腫瘤體積并延長生存時間（圖8b, c）。對切除腫瘤組織的免疫組化分析顯示，OSMI-1組O-GlcNAc糖基化水平較TMG組或DMSO對照組明顯降低（圖8d）。一致性分析表明，OSMI-1處理后腫瘤組織中分化標志物PAEP表達升高，同時多種干性基因表達輕度下調(diào)；而TMG處理則導致PAEP表達下降與干性標志物上調(diào)。

         為探究FBXO31缺失是否促進子宮內(nèi)膜癌（EC）小鼠模型中的腫瘤形成并增強對OSMI-1治療的敏感性，我們將野生型（WT）與FBXO31敲除（FBXO31-KO）的Ishikawa細胞皮下接種于裸鼠。移植10天后，將荷瘤小鼠隨機分組，通過腹腔注射給予DMSO（溶劑對照）或OSMI-1（10 mg/kg/天）（圖8e）。FBXO31-KO細胞形成的腫瘤生長速度顯著快于WT組（圖8f），且干性基因（SOX9、ALDH、OCT4、CD133和SOX2）表達上調(diào)。OSMI-1處理可降低兩組腫瘤組織的O-GlcNAc糖基化水平，抑制干性基因表達，并顯著延緩WT與FBXO31-KO組的腫瘤生長（圖8f）。值得注意的是，FBXO31-KO腫瘤對OSMI-1治療的敏感性較WT組更高（圖8f, g）。此外，CD31免疫熒光染色顯示FBXO31-KO腫瘤具有更豐富的血管網(wǎng)絡（圖8h），而OSMI-1處理能顯著抑制其血管生成（圖8i）。

         綜上，本研究證實FBXO31缺失通過增強腫瘤干性和血管生成促進EC體內(nèi)成瘤，而抑制OGT降低O-GlcNAc糖基化可有效抑制此類腫瘤。這些發(fā)現(xiàn)表明，靶向EC中失調(diào)的O-GlcNAc糖基化穩(wěn)態(tài)是一種具有臨床轉化潛力的治療策略。

圖8 OGT化學抑制抑制小鼠模型子宮內(nèi)膜腫瘤生長

5.相關機制

         本研究深入揭示了O-GlcNAc糖基化穩(wěn)態(tài)與子宮內(nèi)膜癌（EC）進展的分子關聯(lián)，闡明了異常O-GlcNAc糖基化水平的臨床意義，并首次在子宮內(nèi)膜組織中鑒定出一個調(diào)控O-GlcNAc穩(wěn)態(tài)的關鍵分子模塊（圖9）。

結論：

         該研究揭示了FBXO31通過泛素化修飾O-GlcNAc轉移酶OGT來調(diào)控O-GlcNAcylation穩(wěn)態(tài)，并抑制子宮內(nèi)膜惡性腫瘤的進展。研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌（EC）中O-GlcNAcylation水平與組織學分級呈正相關，且與不良預后相關。FBXO31的缺失會導致O-GlcNAcylation水平升高，促進腫瘤細胞增殖和干性特征。通過小鼠模型實驗，研究還證實了靶向OGT的小分子抑制劑能夠限制EC腫瘤的形成，表明靶向O-GlcNAcylation穩(wěn)態(tài)是一種有潛力的治療策略。

         數(shù)據(jù)處理和分析、 虛擬O-GlcNAc指數(shù)計算、GSEA、RNA測序、基因表達譜分析、免疫組化、 免疫熒光分析、 Western blot、 免疫共沉淀、 體外泛素化實驗、 CRISPR-Cas9基因編輯、 小分子抑制劑處理、單細胞RNA測序、細胞培養(yǎng)、 細胞增殖和活力檢測、 細胞凋亡檢測、 細胞分化檢測、小鼠異種移植模型、 腫瘤生長和生存期觀察、 腫瘤組織分析、組織芯片制作、 H&E染色、 TUNEL測定

參考文獻：

         Zhang N, Meng Y, Mao S, Ni H, Huang C, Shen L, Fu K, Lv L, Yu C, Meekrathok P, Kuang C, Chen F, Zhang Y, Yuan K. FBXO31-mediated ubiquitination of OGT maintains O-GlcNAcylation homeostasis to restrain endometrial malignancy. Nat Commun. 2025 Feb 2;16(1):1274.