年輕成纖維細胞來源的遷移體-老年皮膚創(chuàng)面愈合治療的手段
細胞衰老所引發(fā)的細胞間通訊改變是皮膚衰老的一個重要因素。遷移體作為一種新發(fā)現(xiàn)的囊泡狀細胞器，能夠高效地參與細胞間通訊；然而，細胞衰老與遷移體之間的關系目前尚未見報道。單細胞RNA測序數(shù)據(jù)分析顯示，在皮膚衰老過程中，成纖維細胞表現(xiàn)出最高的轉錄變異性，且成纖維細胞的衰老程度與遷移體相關標志物的表達水平呈負相關。進一步的多重免疫組化結果表明，年輕小鼠皮膚中的遷移體數(shù)量多于老年小鼠皮膚。透射電子顯微鏡觀察顯示，年輕個體皮膚中存在大量遷移體。體外實驗表明，與衰老的成纖維細胞相比，年輕成纖維細胞產(chǎn)生的遷移體數(shù)量顯著更多。從年輕成纖維細胞中純化的遷移體能夠降低HaCaT細胞中衰老相關標志物的表達。在體內實驗中，利用自然衰老小鼠的傷口愈合模型，我們觀察到來自年輕成纖維細胞的遷移體不僅能夠加速傷口愈合，還能降低皮膚中衰老相關標志物的表達。總之，在皮膚衰老的進程中，遷移體的形成能力會降低，而源自年輕成纖維細胞的遷移體能夠使衰老的角質形成細胞恢復年輕態(tài)，并促進老年皮膚的傷口愈合。這些發(fā)現(xiàn)為緩解皮膚衰老以及提升老年皮膚傷口愈合能力提供了新的思路。本文于2025年3月發(fā)表于“Journal of Nanobiotechnology”（IF=10.6）上。
技術路線：
結果：
1）在皮膚衰老過程中成纖維細胞表現(xiàn)出最高的轉錄變異性
為了描述皮膚衰老過程中各種細胞類型比例和功能的動態(tài)變化，我們分析了來自人類樣本的單細胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)。我們對包括上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞和免疫細胞在內的11種不同的皮膚細胞類型進行了注釋（圖1A）。為了進一步探究人類皮膚衰老背后的分子變化，我們將與衰老相關的差異表達基因（DEGs）與來自GenAge數(shù)據(jù)庫的衰老和長壽相關基因進行了全面的比較分析。結果顯示，在皮膚衰老過程中，成纖維細胞在所有已鑒定的皮膚細胞類型中表現(xiàn)出最高的轉錄變異性（圖1B和C）。因此，在后續(xù)的分析中，我們將重點放在成纖維細胞上。
2）ScRNA-seq顯示遷移體的形成與細胞衰老呈負相關
TSPAN4已被確定為遷移體形成的關鍵促進因子，且TSPAN4的過表達顯著增強了遷移體的形成能力。為了探究遷移體與衰老之間的關系，我們從GSE130973中針對TSPAN4基因進行了富集分析。有趣的是，結果顯示TSPAN4也主要在成纖維細胞中表達（圖2A）。我們提取了成纖維細胞群（圖2B），并對成纖維細胞進行了獨立分析，結果表明，與遷移體相關的標記物TSPAN4、TSPAN9、CPQ、EOGT、PIGK和NDST1與GenAge數(shù)據(jù)庫中的衰老相關基因呈負相關（圖2C）。這些結果表明，成纖維細胞的衰老過程可能會影響遷移體的形成。
3）成纖維細胞衰老可減少遷移體的形成
為了進一步驗證成纖維細胞中遷移體的形成與衰老之間的關系，我們使用來自三只年輕（8周齡）和三只老年（64周齡）C57BL/6J小鼠的皮膚組織進行了多重免疫組化（mIHC）分析。我們使用波形蛋白（Vimentin）標記成纖維細胞，并通過TSPAN4與WGA的共定位來指示遷移體。年輕小鼠的皮膚顯示出波形蛋白、TSPAN4和WGA更高的共定位比例，這表明年輕成纖維細胞產(chǎn)生的遷移體更多（圖3A）。為了進一步確認皮膚中遷移體的存在，我們使用透射電子顯微鏡分析了年輕個體的皮膚。我們在真皮乳頭層中觀察到了顯著的遷移體樣結構積累（黃色箭頭）（圖3B）。為了進一步驗證成纖維細胞的衰老過程可能會抑制遷移體的形成，我們進行了體外實驗。非衰老的成纖維細胞比衰老的成纖維細胞能更顯著地形成遷移體（圖3C和E），這一結果通過掃描電子顯微鏡得到了證實（圖3D和F）。此外，與遷移體相關的標志物包括EOGT、PIGK和TSPAN4在非衰老的成纖維細胞中顯著上調（圖3G）。這些發(fā)現(xiàn)共同支持了我們的假設，即年輕的成纖維細胞比衰老的成纖維細胞能更有效地產(chǎn)生遷移體。
4）年輕成纖維細胞遷移體緩解HaCaT細胞衰老
考慮到遷移體主要沉積在表皮-真皮交界處附近，且成纖維細胞與上皮細胞之間的相互作用在皮膚衰老過程中起著關鍵作用，我們進一步研究了成纖維細胞來源的遷移體對上皮細胞衰老的影響。為此，我們首先從年輕人中提取了成纖維細胞，并通過波形蛋白免疫熒光染色進行了鑒定。隨后，我們通過密度梯度離心法純化了來自年輕成纖維細胞的遷移體（圖4A）。純化后的遷移體呈現(xiàn)出典型的石榴狀結構，具有可見的相互連接的收縮纖維結構，直徑約為0.5–3微米（圖4B）。在純化的樣本中，與遷移體相關的標志物高表達（圖4C）。為了探究遷移體是否能被衰老的HaCaT細胞內化，我們將WGA標記的遷移體引入衰老的HaCaT細胞中。結果顯示，遷移體在細胞內分散分布（圖4D）。隨后，我們用不同濃度的成纖維細胞來源的遷移體（2.5、5、7.5和10 μg/ml）處理衰老的HaCaT細胞。來自年輕成纖維細胞的遷移體降低了SA-β-gal陽性細胞的比例（圖4E和G）。Western blot顯示，遷移體顯著降低了H?O?誘導的p16和p21表達升高（圖4F、H和I）。根據(jù)這些結果，我們發(fā)現(xiàn)10 μg/ml的濃度效果最佳，因此在后續(xù)細胞實驗中使用了這一濃度。
5）年輕的成纖維細胞衍生的遷移體促進衰老的HaCaT細胞功能
我們進一步研究了來自年輕成纖維細胞的遷移體對衰老HaCaT細胞功能的影響。Ki-67免疫熒光染色結果顯示，成纖維細胞來源的遷移體增強了衰老HaCaT細胞的增殖活性（圖5A和B）。劃痕實驗（圖5C和F）和transwell遷移實驗（圖5D和G）表明，來自年輕成纖維細胞的遷移體顯著提高了衰老HaCaT細胞的遷移能力。考慮到活性氧（ROS）與衰老之間的關聯(lián)，我們檢測了ROS水平。結果顯示，遷移體降低了衰老HaCaT細胞中升高的ROS水平（圖5E和H）。這些結果表明，成纖維細胞來源的遷移體能夠緩解HaCaT細胞的衰老。
6）年輕成纖維細胞衍生的遷移體促進衰老小鼠皮膚傷口愈合
考慮到衰老會損害受損組織的再生能力以及來自年輕成纖維細胞的遷移體對HaCaT細胞的影響，我們進一步研究了這些遷移體是否也能促進老年皮膚中的傷口愈合。我們建立了一個全層皮膚傷口模型。小鼠被隨機分為四組：年輕小鼠組（Y）、老年小鼠對照組（AC）、老年小鼠注射磷酸鹽緩沖液（PBS）組（AP）和老年小鼠注射遷移體組（AM）。AP和AM組在傷口周圍進行了皮下注射，每處注射25 μg（共四處）。我們在第0、3、5、7和12天對模型進行拍照和記錄，并在第12天采集樣本（圖6A）。觀察結果顯示，年輕小鼠組的愈合速度顯著快于AC和AP組，這凸顯了衰老對傷口愈合的不利影響。AP組和AC組之間沒有顯著差異，但AM組的愈合速度顯著快于AC和AP組。有趣的是，在最初的7天內，AM組的愈合能力甚至優(yōu)于年輕小鼠組，但隨后被年輕小鼠組超越。這種現(xiàn)象可能是由于AM組在受傷7天后遷移體被耗盡所致（圖6B、C和D）。HE染色顯示，AC和AP組的再上皮化過程雜亂無章，而AM組則表現(xiàn)出更優(yōu)越的再上皮化（圖6E）。Masson染色表明，與AC和AP組相比，AM組的真皮厚度增加，膠原纖維形成更多（圖6F）。
7）年輕成纖維細胞來源的遷移體減少衰老細胞和SASP
先前的研究已報道，通過靶向細胞衰老來增強傷口愈合主要涉及減少衰老細胞和衰老相關分泌表型（SASP）。因此，我們通過免疫組化和Western blot探討了遷移體注射對衰老細胞和SASP的影響。免疫組化分析顯示，與AC和AP組相比，AM組和年輕小鼠組（Y）的p21蛋白水平顯著降低（圖7A和D）。同樣，與AC和AP組相比，AM組和Y組的SA-β-gal蛋白水平也顯著下調（圖7B和E）。相反，與AC和AP組相比，AM組和Y組的Ki-67蛋白水平顯著上調（圖7C和F）。這些結果表明，注射遷移體顯著減少了衰老細胞的數(shù)量。我們還檢測了促炎細胞因子IL-1β、IL-6和MMP-14。與AC和AP組相比，AM組和Y組的IL-1β、IL-6和MMP-14蛋白水平顯著下調（圖7G），這表明遷移體可以緩解SASP。
結論：
本研究揭示了在成纖維細胞衰老和皮膚衰老過程中，遷移體的形成能力顯著下降。此外，源自年輕成纖維細胞的遷移體能夠使衰老的角質形成細胞恢復活力，并促進老年皮膚的傷口愈合。這些發(fā)現(xiàn)為針對皮膚衰老的新療法開發(fā)提供了新穎的見解和方向。
實驗方法：
單細胞測序，遷移體分離，Western blotting，免疫熒光，Transwell，劃痕實驗，免疫組化。
參考文獻：
Tu H, Shi Y, Guo Y, Zou Z, He Y, Zhou J, He S, Sa G. Young fibroblast-derived migrasomes alleviate keratinocyte senescence and enhance wound healing in aged skin. J Nanobiotechnology. 2025 Mar 11;23(1):200. doi: 10.1186/s12951-025-03293-2.