抑制低氧外泌體miR-423-3p通過限制星形膠質(zhì)細(xì)胞的自噬來減少膠質(zhì)瘤的進(jìn)展

         膠質(zhì)瘤的腫瘤微環(huán)境（TME）包括膠質(zhì)瘤細(xì)胞和周圍的細(xì)胞，如星形細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和神經(jīng)元。在TME中，膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以通過分泌外泌體來激活正常人類星形細(xì)胞（NHAs），而星形細(xì)胞的激活可以進(jìn)一步促進(jìn)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。然而，膠質(zhì)瘤激活NHAs的分子機(jī)制在很大程度上仍然未知。在這項(xiàng)研究中，膠質(zhì)瘤衍生的外泌體（GDEs）在調(diào)節(jié)自噬和激活NHAs中起著重要作用。與常氧GDEs相比，缺氧膠質(zhì)瘤衍生的外泌體（H-GDEs）進(jìn)一步改善了星形細(xì)胞的自噬和激活，這極大地促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的進(jìn)展。在來自膠質(zhì)瘤的兩種外泌體之間的miRNA陣列中，miR-423-3p在H-GDEs中高表達(dá)，并在自噬中發(fā)揮了重要作用，導(dǎo)致NHAs的激活。確定了缺氧膠質(zhì)瘤細(xì)胞與NHAs反應(yīng)以創(chuàng)建免疫抑制微環(huán)境的機(jī)制，并建立了15d-PGJ2作為抑制miR-423-3p以抑制NHAs激活的有效抑制劑。這些發(fā)現(xiàn)為通過靶向自噬和miR-423-3p表達(dá)提供了對(duì)膠質(zhì)瘤診斷和治療的新見解。本文于2025年4月發(fā)表于“Cell Death and Disease”（IF=8.1）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）H-GDEs誘導(dǎo)體外NHAs細(xì)胞自噬

         為了研究GDEs對(duì)星形細(xì)胞功能的影響，從在常氧（N-GDEs）和缺氧（H-GDEs）條件下培養(yǎng)的U251和P3#GBM細(xì)胞中提取了GDEs。透射電子顯微鏡（TEM）顯示，從上清液中提取的內(nèi)容物是直徑為30-100 nm的圓形物體（圖1A），這表明外泌體的成功提取。此外，Western blotting顯示，在提取的囊泡中，外泌體標(biāo)記物的表達(dá)豐富，包括CD9和TSG101，而calnexin未被檢測(cè)到（圖1B）。由于假設(shè)缺陷自噬會(huì)觸發(fā)反應(yīng)性星形細(xì)胞，因此研究了GDEs對(duì)星形細(xì)胞中自噬的影響。使用TEM測(cè)量自噬體的形成。與N-GDE處理相比，H-GDE處理后的自噬體體積顯著增加（圖1C，D）。使用Western blotting檢測(cè)NHA中與自噬相關(guān)的分子LC3B和P62的表達(dá)（圖1E）。N-GDEs和H-GDEs均增加了NHA中的自噬，其中H-GDEs處理的星形細(xì)胞中自噬增加更為顯著，這表明GDEs直接影響星形細(xì)胞中的自噬。同樣，根據(jù)免疫熒光染色，星形細(xì)胞在暴露于來自U251和P3#GBM（圖1F）的H-GDEs后，其內(nèi)的LC3B增加。使用3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制自噬減弱了H-GDE處理的NHA中LC3B的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)H-GDEs促進(jìn)星形細(xì)胞中的自噬（圖1G）。此外，進(jìn)行了siRNA介導(dǎo)的beclin1敲除，并使用Western blotting驗(yàn)證了這種敲除的有效性作為抑制自噬的替代方法。與3-MA處理一致，beclin1的敲除導(dǎo)致LC3B類似的下調(diào)（圖1H）。值得注意的是，3-MA和beclin1沉默均有效逆轉(zhuǎn)了H-GDE誘導(dǎo)的自噬體組裝（圖1I，J）。此外，Western blotting顯示，在使用這些抑制劑治療后，LC3B的表達(dá)如預(yù)期的那樣下調(diào)，同時(shí)P62的表達(dá)上調(diào)（圖1K）。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了H-GDEs誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬的能力。

2）H-GDEs比N-GDEs更能誘導(dǎo)NHAs活化

         鑒于GDEs可以誘導(dǎo)NHA中的自噬，因此確定了GDEs對(duì)星形細(xì)胞功能的后續(xù)影響。使用EdU和Transwell測(cè)定，我們發(fā)現(xiàn)N-GDEs和H-GDEs均增強(qiáng)了NHA的增殖和遷移，其中H-GDEs的效果比N-GDEs更強(qiáng)（圖2A，C，E）。ELISA顯示，NHA增殖和遷移的增加伴隨著H-GDE處理的細(xì)胞中IL-6和IL-8分泌的顯著增加（圖2I）。GFAP是反應(yīng)性星形細(xì)胞的經(jīng)典標(biāo)記物，因此，在用N-GDEs和H-GDEs處理后評(píng)估了GFAP的表達(dá)。研究結(jié)果顯示，NHA在暴露于H-GDEs后，GFAP表達(dá)顯著上調(diào)（圖1G），證實(shí)了H-GDEs在星形細(xì)胞激活中的強(qiáng)效前反應(yīng)作用。接下來，研究了自噬是否在這一轉(zhuǎn)變中發(fā)揮作用。在H-GDE處理的組中，通過3-MA抑制自噬或敲低beclin1減弱了H-GDE誘導(dǎo)的IL-6和IL-8的分泌（圖2J）。然后研究了GDEs暴露后NHA中觀察到的功能變化是否由自噬介導(dǎo)。EdU和Transwell測(cè)定還顯示，自噬的下調(diào)阻斷了H-GDEs對(duì)NHA增殖和遷移的影響（圖2B，D，F）。此外，Western blotting揭示，通過3-MA或beclin1的基因敲低實(shí)現(xiàn)的抑制自噬，導(dǎo)致GFAP表達(dá)顯著降低（圖2G）?？偟膩碚f，這些結(jié)果強(qiáng)烈表明H-GDEs可以通過調(diào)節(jié)自噬誘導(dǎo)NHA轉(zhuǎn)變?yōu)榉磻?yīng)表型。

3）H-GDEs通過miR-423-3p誘導(dǎo)NHAs細(xì)胞自噬，其作用可被3-MA抑制

         外泌體可以在細(xì)胞之間運(yùn)輸miRNAs 。為了確定導(dǎo)致NHA轉(zhuǎn)化的GDE相關(guān)的miRNA，使用miRNA陣列分析了來自U251和P3#GBM細(xì)胞的N-GDEs和H-GDEs中的miRNA含量（圖3A）。比較了N-GDEs和H-GDEs中差異表達(dá)的miRNA，并鑒定了從兩種細(xì)胞系中提取的H-GDEs中高表達(dá)的top 10 miRNA（圖3B）。確定了這10個(gè)miRNA對(duì)NHA中自噬調(diào)節(jié)的影響。MiR-423-3p顯著提高了NHA中LC3B的表達(dá)，通過半定量測(cè)量（圖3C，D），表明其在調(diào)節(jié)自噬中的重要作用。對(duì)來自P3#GBM細(xì)胞（圖3E）的N-GDEs和H-GDEs進(jìn)行了qRT-PCR，證實(shí)了miR-423-3p的上調(diào)。此外，與來自健康患者的血液中收集的外泌體相比，來自GBM患者的血液中收集的外泌體的表達(dá)水平更高（圖3F）。Western blotting和免疫熒光圖像顯示，miR-423-3p增加了NHA中的自噬（圖3G，I）。當(dāng)在miR-423-3p轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中敲低beclin1時(shí)，觀察到了相同的趨勢(shì)（圖3H，I），表明了miR-423-3p的自噬誘導(dǎo)效應(yīng)。鑒于miRNA-423-3p可以誘導(dǎo)自噬，研究了miR-423-3p是否介導(dǎo)GDEs對(duì)自噬的影響。與對(duì)照相比，提取的GDEs顯著上調(diào)了NHA中的LC3B（圖3J，L），并且使用針對(duì)miR-423-3p的抑制RNA消除了NHA中LC3B的上調(diào)（圖3L）。LC3B的免疫熒光染色顯示出了相似的結(jié)果（圖3K）。在形態(tài)上，miR-423-3p誘導(dǎo)了自噬體的形成，這被3-MA、beclin1敲低和miRNA抑制劑所抑制（圖3M，N）?？偟膩碚f，miR-423-3p在誘導(dǎo)NHA自噬中發(fā)揮了重要作用。

4）miR-423-3p誘導(dǎo)的H-GDEs自噬促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化

         MiR-423-3p誘導(dǎo)NHA中的自噬，因此，研究了miR-423-3p是否促進(jìn)了星形細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。使用miR-423-3p模擬物轉(zhuǎn)染NHA，并使用3-MA或beclin1敲低RNA進(jìn)行自噬抑制處理。Transwell和EdU測(cè)定顯示，miR-423-3p顯著增加了NHA的增殖和遷移，這被自噬抑制所減弱（圖4A，C，E，F）。使用ELISA和Western blotting，我們證實(shí)miR-423-3p增加了星形細(xì)胞中IL-6和IL-8的分泌（圖4I），并上調(diào)了GFAP的表達(dá)（圖4G）。這些結(jié)果表明miRNA-423-3p促進(jìn)了NHA向RA的轉(zhuǎn)變。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-423-3p是否介導(dǎo)GDEs對(duì)NHA轉(zhuǎn)化的影響，從常氧條件下過表達(dá)miR-423-3p的P3#GBM細(xì)胞中提取GDEs來處理NHA。將含有抑制miR-423-3p的miRNA的H-GDEs添加到另一組中。MiR-423-3p顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)化，而抑制RNA則挽救了H-GDE誘導(dǎo)的NHA轉(zhuǎn)化（圖4B，D-F，H，J）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明H-GDEs中的miR-423-3p通過自噬促進(jìn)了NHA的腫瘤促進(jìn)轉(zhuǎn)化。

5）H-GDEs中miR-423-3p誘導(dǎo)的RAs在體內(nèi)促進(jìn)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展

         鑒于膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以通過外泌體機(jī)制誘導(dǎo)NHA向RA的轉(zhuǎn)變，研究了GDEs或miR-423-3p誘導(dǎo)的星形細(xì)胞轉(zhuǎn)化是否可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。將用PBS、N-GDEs和H-GDEs預(yù)處理的P3#GBM細(xì)胞和星形細(xì)胞共植入裸鼠的大腦中，并通過尾靜脈每3天給小鼠注射PBS、N-GDEs和H-GDEs。植入后1周和4周通過生物發(fā)光成像測(cè)量的腫瘤體積顯示，與另外兩組小鼠相比，用H-GDE處理的小鼠的腫瘤體積顯著更大（圖5A，B）。隨后，用H-GDE處理的小鼠的生存時(shí)間比其他組的小鼠短（圖5C）。H&E和Ki67的免疫組化染色顯示，H-GDE處理組的腫瘤邊界不清且Ki67表達(dá)高。還對(duì)星形細(xì)胞標(biāo)記物GFAP進(jìn)行了染色；用H-GDE處理的NHA表現(xiàn)出異形GFAP的高表達(dá)，分支數(shù)量明顯增加（圖5D）。此外，LC3B和GFAP的共免疫染色顯示，H-GDE處理顯著增加了NHA中LC3B和異常GFAP的表達(dá)（圖5E），表明H-GDE可以在體內(nèi)促進(jìn)NHA的自噬和轉(zhuǎn)化。在確認(rèn)了H-GDEs在體內(nèi)促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展的作用后，研究了miR-423-3p對(duì)腫瘤進(jìn)展的影響。將NHA用lenti-miR-control或lenti-ov-miR-423-3p病毒轉(zhuǎn)染，并與P3#GBM細(xì)胞一起植入裸鼠中以生成原位異種移植。生物發(fā)光成像顯示，到第4周時(shí)，miR-423-3p增加了裸鼠的腫瘤大?。▓D5F，G）。此外，植入小鼠的存活率低于對(duì)照組小鼠（圖5H）。一致地，H&E染色顯示miR過表達(dá)組中有強(qiáng)烈的腫瘤浸潤(rùn)（圖5I）。此外，Ki67和GFAP的IHC染色顯示，miR-423-3p誘導(dǎo)的NHA激活促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的增殖率和NHA中異形GFAP的表達(dá)（圖5I，J）。共免疫染色進(jìn)一步表明，與對(duì)照小鼠相比，lenti-miR-423-3p表達(dá)小鼠的LC3B和異形GFAP水平更高（圖5K）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明，來自H-GDEs的miR-423-3p可以促進(jìn)TME中NHA向RA的轉(zhuǎn)變，并隨后在體內(nèi)促進(jìn)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。

6）LAMP3是miR-423-3p的下游靶基因，在NHAs中參與自噬

         為了檢測(cè)miR-423-3p在調(diào)節(jié)自噬過程中的下游基因，我們使用了qPCR陣列來探測(cè)轉(zhuǎn)染了對(duì)照和miR-423-3p模擬物的NHA細(xì)胞中與自噬相關(guān)的靶基因（圖6A，B）。根據(jù)之前的研究，LAMP3可能是miR-423-3p的下游靶點(diǎn)，其功能與自噬密切相關(guān)。通過Western blotting比較了來自U251和P3#GBM細(xì)胞的PBS、N-GDEs和H-GDEs處理的NHA細(xì)胞中LAMP3的表達(dá)。H-GDEs顯著增加了NHA細(xì)胞中LAMP3的表達(dá)（圖6C）。此外，在轉(zhuǎn)染了miR-423-3p的NHA細(xì)胞中，LAMP3的表達(dá)增加，當(dāng)自噬被抑制時(shí)，這種趨勢(shì)被逆轉(zhuǎn)（圖6D）。這些實(shí)驗(yàn)表明LAMP3可能參與了miR-423-3p對(duì)自噬誘導(dǎo)的影響。進(jìn)一步的pull-down實(shí)驗(yàn)顯示miR-423-3p與LAMP3之間存在直接相互作用，進(jìn)一步支持了這一推測(cè)（圖6E）。

7）15d-PGJ2可以抑制miR-423-3p的活性，抑制NHAs的激活

         為了識(shí)別可能抑制miR-423-3p活性的藥物，我們對(duì)用miR-control或miR-423-3p處理的NHA進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，這使我們能夠識(shí)別差異表達(dá)基因（圖7A，B）。KEGG富集分析顯示，差異表達(dá)基因與溶酶體功能、線粒體自噬和代謝途徑相關(guān)，所有這些都與自噬有關(guān)（圖7C）。此外，GO富集分析突出了外泌體和焦點(diǎn)黏附，有助于隨后形成膠質(zhì)瘤微環(huán)境（圖7D）。我們使用CMap數(shù)據(jù)庫(kù)基于差異表達(dá)基因預(yù)測(cè)潛在藥物。預(yù)測(cè)能通過血腦屏障（BBB）的前三種藥物是GDC-0879、15d-PGJ2和linsitinib（圖7E）。在5 μM濃度下，15d-PGJ2對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和外泌體均表現(xiàn)出強(qiáng)效抑制作用，這使其效力與GDC-0879和linsitinib區(qū)分開來（圖7F）。結(jié)合使用CCK-8測(cè)試的IC50（圖7G），這些候選物的分子拓?fù)錁O性表面積和分子量，我們選擇了15d-PGJ2進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。在NHA中，15d-PGJ2處理導(dǎo)致miR-423-3p誘導(dǎo)的遷移率（圖7H）、GFAP水平（圖7I）和增殖率（圖7J）降低。隨后，觀察到當(dāng)與用15d-PGJ2預(yù)處理的NHA共培養(yǎng)時(shí)，P3#GBM細(xì)胞的增殖率降低（圖7K），這突出了這種化合物在復(fù)雜細(xì)胞微環(huán)境中對(duì)GBM細(xì)胞增長(zhǎng)的潛在抗增殖效應(yīng)。因此，15d-PGJ2被預(yù)測(cè)為一種有前途的抑制劑，可減少NHA的激活和TME的形成。

結(jié)論：

         這項(xiàng)研究揭示了一種正反饋機(jī)制，通過這種機(jī)制，膠質(zhì)瘤觸發(fā)星形細(xì)胞激活，而星形細(xì)胞激活反過來又促進(jìn)膠質(zhì)瘤的惡性程度。此外，膠質(zhì)瘤通過分泌含有miR-423-3p的外泌體，促進(jìn)了NHA向RA的轉(zhuǎn)變，隨后通過自噬誘導(dǎo)星形細(xì)胞反應(yīng)性。

實(shí)驗(yàn)方法：

         Western blot，Pull down，免疫熒光，ELISA，qRT?PCR，EdU，Transwell，CCK-8，RNA-seq，免疫組化。

參考文獻(xiàn)：

         Tang Z, Xue Z, Liu X, Zhang Y, Zhao J, Liu J, Zhang L, Guo Q, Feng B, Wang J, Zhang D, Li X. Inhibition of hypoxic exosomal miR-423-3p decreases glioma progression by restricting autophagy in astrocytes. Cell Death Dis. 2025 Apr 8;16(1):265. doi: 10.1038/s41419-025-07576-2.