活化的 AXL 通過抑制 ER 應激和線粒體相關凋亡改善酒精相關性脂肪肝缺血再灌注損傷

        肝臟缺血再灌注（I/R）損傷會導致肝移植和肝切除術的預后不良，尤其是酒精相關性肝病（ALD）患者。細胞凋亡與肝損傷的不同階段密切相關，內質網（ER）和線粒體平衡紊亂導致的肝細胞死亡可能是肝損傷的關鍵。由基因axl 編碼的受體酪氨酸激酶AXL 是TAM（TYRO3、AXL和MERTK）家族的成員，它通過與生長停滯特異性蛋白6（Gas6）的配體結合參與各種生物過程。然而，AXL是否參與細胞凋亡通路，以及其在肝臟I/R 損傷中的具體機制仍不清楚。在本研究中，作者發(fā)現在肝移植的人肝組織中，I/R后總AXL 上調，而磷酸化AXL（p-AXL，AXL的活性形式）下調。同樣，在小鼠肝臟I/R 損傷過程中，發(fā)現總AXL 上調，而p-AXL 下調。在小鼠肝臟I/R 損傷過程中，Gas6的預處理增加p-AXL的表達，減少ER 應激相關的細胞凋亡，減輕肝損傷，并恢復ER和線粒體的超微結構。此外，通過ALD模型發(fā)現ALD小鼠的p-AXL水平較低，更容易受到肝臟I/R損傷。重要的是，活化的AXL通過抑制IRE1和PERK通路來減少ER應激相關的細胞凋亡，從而改善肝損傷?？傊?，活化的AXL通過抑制ER應激和線粒體相關的細胞凋亡，保護酒精相關性脂肪變性肝臟免受I/R損傷。該研究于2025年1月發(fā)表在《International Journal of Biological Sciences》，IF：8.2。

技術路線：

主要研究結果：

1.肝臟 AXL 的磷酸化在 I/R 損傷期間下調

        為了研究總AXL/p-AXL在手術缺血條件下是否失調，以及它們是否參與了人類肝臟I/R損傷，檢測它們在供體移植物肝臟活檢組織和對照組中的表達情況。結果顯示，供體肝臟中總 AXL 的表達水平高于對照組，而 p-AXL 的表達趨勢則相反（圖 1A-C）。為了探討肝臟 I/R 期間總 AXL/p-AXL 的變化趨勢，我們構建了缺血 60 分鐘后不同再灌注時間的小鼠模型。小鼠血清中的肝酶（ALT/AST）水平在I/R損傷后6小時前逐漸升高，之后隨著時間的推移逐漸恢復（圖1D）。同樣，AXL的總表達也在6小時達到峰值，然后逐漸恢復到基礎水平。在此過程中，p-AXL 的表達在 6 h 時最低（圖 1E&F）。同時，我們在體外對原代肝細胞進行 OGD/R 處理，總 AXL/p-AXL 的表達與小鼠肝 I/R 期間觀察到的趨勢相同（圖 1G&H）。令人印象深刻的是，檢測肝臟 I/R 小鼠血清中的可溶性 AXL（sAXL）發(fā)現 sAXL 大大升高?？扇苄?span> AXL 是總 AXL 的裂解產物，沒有生理活性，但可以競爭性阻斷 AXL 受體。這一結果為肝臟 I/R 期間總 AXL 的增加和 p-AXL 的減少提供了解釋（圖 1I）。因此，在肝臟 I/R 期間，AXL 的磷酸化會減少。

圖1.肝臟AXL 的磷酸化在I/R 損傷期間下調

2.活化的 AXL 通過抑制細胞凋亡防止肝臟 I/R 損傷

        為探討AXL抑制是否會導致I/R損傷及其詳細機制，使用外源性rmGas6腹腔注射激活AXL。與人體樣本的研究結果一致，肝臟 I/R 小鼠體內 p-AXL 的表達量減少。當用rmGas6激活AXL時，p-AXL水平的升高表明AXL被激活了（圖2A）。與假手術組相比，肝I/R損傷導致肝損傷和血清中ALT和AST水平升高，而注射rmGas6可逆轉這些影響。同樣，AXL 的特異性抑制劑 R428 會顯著加劇肝壞死面積以及 ALT 和 AST 血清水平的升高（圖 2B-D）。此外，肝臟 I/R 小鼠體內促凋亡蛋白裂解的 Caspase-3（Caspase-3 的活性形式）水平升高，而使用 rmGas6 預處理可逆轉這些趨勢。肝組織切片的TUNEL檢測和裂解的Caspase-3免疫組化染色也證實，活化的AXL通過抑制體內細胞凋亡保護肝臟免受I/R損傷（圖2E-H）。這些數據表明，激活 AXL 可通過抑制細胞凋亡保護肝臟免受 I/R 損傷。

圖2.活化的AXL 通過抑制細胞凋亡防止肝臟I/R 損傷

3.活化的 AXL 可減輕肝臟 I/R 損傷過程中的 ER 應激和線粒體相關凋亡

        為進一步研究AXL是否會影響肝臟I/R過程中的ER，用TEM檢測肝組織的超微結構。發(fā)現ER 在 I/R 后出現異常，擴張、空泡化和片狀折疊管狀結構消失。rmGas6預處理組的損傷得到緩解，ER結構相對完整，而R428則加劇IR誘導的損傷（圖3A）。Western 印跡結果顯示，BiP、CHOP 和裂解的 Caspase-12（Caspase-12 的活性形式）水平上調，這表明肝 I/R 導致 ER 應激及其相關的細胞凋亡。然而，rmGas6預處理逆轉了這些影響，R428預處理加重IR誘導的過度ER應激和細胞凋亡（圖3B&C）。肝組織 CHOP 染色免疫組化也表明，rmGas6 預處理可抑制 CHOP 上調，從而減輕肝損傷（圖 3D）。在真核細胞中，有三種ER跨膜蛋白介導典型的UPR：兩種激酶IRE1和PERK，以及轉錄因子前體ATF6。至于細胞凋亡效應，前兩個激酶 IRE1 和 PERK 主要參與其中。Western 印跡分析發(fā)現，肝臟 I/R 使磷酸化-IRE1（p-IRE1，IRE1 的活性形式）及其下游效應物 XBP1s、磷酸化-PERK（p-PERK，PERK 的活性形式）及其下游 ATF4 水平升高，而 rmGas6 預處理可逆轉所有這些趨勢（圖 3E）。因此，這些研究結果表明，活化的AXL可抑制ER應激中UPR的IRE1和PERK分支，從而保護肝臟免受I/R損傷。值得注意的是，TEM 觀察到的超微結構變化也表明 I/R 后線粒體腫脹和嵴模糊，而活化的 AXL 也能顯著恢復線粒體的超微結構（圖 3A）。作為內源性凋亡的經典途徑，作者還研究了 p-AXL 是否在線粒體相關凋亡中發(fā)揮作用。結果顯示，在小鼠肝臟 I/R 損傷過程中，活化的 AXL 可抑制裂解的 Caspase-9（Caspase-9 的活性形式）和 Bax 的水平，同時增加 Bcl-2 的表達（圖 3F&G）。所有這些都證實，激活AXL可減輕肝臟I/R損傷過程中的ER應激和線粒體相關的細胞凋亡。

圖3.活化的AXL 可減輕肝臟I/R 損傷過程中的ER 應激和線粒體相關凋亡

4.在體外 OGD/R 過程中，激活 AXL 可減輕 ER 應激和線粒體相關肝細胞凋亡

        與圖 3 所示的體內實驗一致，OGD/R 誘導的 ER 應激導致終末 UPR 信號（如 BiP、CHOP 和 Caspase-12）反應，而 rmGas6 在體外的預處理可減輕這種反應（圖 4A）。熊去氧膽酸（TUDCA）是一種公認的ER應激抑制劑，它能以劑量依賴的方式充分阻斷OGD/R處理的肝細胞中的ER應激反應（圖4B）。正如預期的那樣，用 rmGas6 激活的 AXL 能顯著抑制體外經 OGD/R 處理的原代肝細胞中 p-IRE1、XBP1s、p-PERK 和 ATF4 的水平（圖 4C）。用 rmGas6 預處理的效果與 TUDCA 相似，而且 TUDCA 的應用逆轉了 R428 的有害影響（圖 4D）。此外，rmGas6預處理通過降低體外OGD/R誘導的線粒體相關肝細胞凋亡中裂解的Caspase-9和Bax的表達，同時提高Bcl-2的水平，阻礙了OGD/R誘導的線粒體相關肝細胞凋亡（圖4E）。此外，原代肝細胞中 JC-1 的免疫熒光染色也表明 OGD/R 期間線粒體膜電位（MMP）降低，表現為 JC-1 聚集體（紅色熒光）減少，JC-1 單體（綠色熒光）增加。值得注意的是，rmGas6 預處理可恢復 MMP，這也表明活化的 AXL 可減輕肝 I/R 損傷期間線粒體相關的細胞凋亡（圖 4F）。此外，流式細胞術檢測證實，rmGas6 和 TUDCA 預處理均可減少 OGD/R 誘導的線粒體凋亡（圖 4F）。此外，流式細胞術檢測證實，rmGas6 和 TUDCA 預處理均可減少 OGD/R 誘導的細胞凋亡（圖 4G）。這些結果進一步驗證 p-AXL 在原代肝細胞 OGD/R 過程中抑制 ER 應激和線粒體相關的細胞凋亡。

圖4.在體外OGD/R 過程中，激活AXL 可減輕ER 應激和線粒體相關肝細胞凋亡

5.ALD小鼠肝臟中磷酸化AXL下調，對I/R損傷的易感性增加

        一些接受肝切除術的患者或患有ALD的供體出現肝切除術后肝功能衰竭的風險較高，因為這兩種情況都會加重I/R損傷。因此，采用慢性加暴飲暴食酒精（Gao-binge）喂養(yǎng)，然后進行I/R手術的方法來研究乙醇相關脂肪變性的肝臟I/R損傷（圖S2A）。觀察到 ALD 小鼠肝臟的宏觀變黃、腫大和龜甲紋細節(jié)（圖 S2B）。組織病理學研究顯示，與等熱量配對飼養(yǎng)的小鼠（配對組）相比，ALD 小鼠（ALD 組）出現了明顯的微小骨質疏松和大骨質疏松，以及肝細胞氣球化（圖 5A）。油紅 O 染色也證實了ALD 小鼠嚴重的肝臟脂肪變性和脂質堆積（圖 5B）。ALD 小鼠血清中的 ALT/AST 水平也有所升高（圖 5C）。免疫組化染色顯示，在大量長期飲酒導致的終末期肝病患者的肝臟中，p-AXL 的表達下調（圖 5D）。Western 印跡證實 p-AXL 水平在 ALD 小鼠肝臟（圖 5E）中下調。此外，與配對組相比，TEM 顯示 ALD 小鼠肝臟中有脂滴、相對擴張的 ER 管腔、腫脹的線粒體和模糊的嵴（圖 5F）。更重要的是，與配對組相比，ALD小鼠在I/R后出現了更嚴重的肝損傷，壞死面積更大，血清轉氨酶（ALT/AST）水平更高（圖5G&H）。此外，與Pair組相比，ALD小鼠肝臟I/R后p-AXL水平下調，而裂解的Caspase-12、裂解的Caspase-9和裂解的Caspase-3的表達水平顯著上調（圖5I）。TEM顯示，與Pair組相比，ALD小鼠肝臟中的ER擴張、線粒體腫脹和空泡變性更為嚴重（圖5J）?？傊@些研究有力地證明酒精相關肝病誘導ER應激和線粒體相關凋亡，增加小鼠肝臟對I/R損傷的易感性，而p-AXL可能參與發(fā)病機制。

圖5.ALD小鼠肝臟中磷酸化AXL下調，對I/R損傷的易感性增加

6.通過減少 ALD 小鼠的 ER 應激和線粒體相關凋亡，激活 AXL 可減輕肝臟 I/R 損傷

        如上所述，ALD 小鼠因ER 應激和線粒體相關凋亡而遭受更嚴重的肝臟 I/R 損傷。接下來研究活化的 AXL 對 ALD 小鼠的 I/R 損傷是否也有保護作用。rmGas6預處理可減輕紅外誘導的肝損傷，這表現在壞死面積減少（圖 6A&B）和血清轉氨酶水平（ALT/AST）降低（圖 6C）。此外，用 rmGas6 預處理可減輕 ALD 小鼠肝臟 I/R 損傷過程中線粒體相關的細胞凋亡（圖 6D），還可減少 ER 應激相關的細胞凋亡（圖 6E）。此外，TUNEL也表明，AXL的激活減少了IR誘導的小鼠肝組織凋亡（圖6F）。此外，TEM直觀地顯示，rmGas6預處理有助于ER和線粒體從肝臟I/R損傷中恢復。相反，用 R428 抑制 AXL 會加劇 ER 的擴張和細胞凋亡，從而大大加重肝臟 I/R 損傷（圖 6G）。綜上所述，這些研究為活化的AXL在ALD小鼠肝臟I/R損傷過程中抑制ER應激和線粒體相關凋亡的保護作用提供了實驗證據。

圖6.通過減少ALD 小鼠的ER 應激和線粒體相關凋亡，激活AXL 可減輕肝臟I/R 損傷

結論

        綜上所述，本研究表明，激活 AXL 可抑制 ER 應激和線粒體相關的細胞凋亡，從而保護酒精性脂肪肝免受缺血再灌注損傷。這些研究結果表明，以AXL為靶點可能是治療肝臟缺血再灌注損傷的一種有前途的策略，特別是對于酒精性脂肪肝的邊緣肝臟供體。

實驗方法

        基因和蛋白表達分析、蛋白質組學分析、Western blot、免疫組化、免疫熒光染色、細胞培養(yǎng)、OGD/R模型構建、細胞死亡實驗、肝臟I/R模型構建、ALD模型構建、肝功能分析、組織病理學檢查、透視電子顯微鏡

參考文獻

        Fang Q, Yan Q, Liu X, Zhang X, Zha L, Zhang R, Gao Z, Du J, Chen L. Activated AXL Ameliorates Alcohol-associated Steatotic Liver Ischemia-Reperfusion Injury by Inhibiting ER stress and Mitochondria-associated Apoptosis. Int J Biol Sci. 2025 Jan 20;21(3):1294-1307. doi: 10.7150/ijbs.103789. PMID: 39897049; PMCID: PMC11781187.