抑制EZH1/EZH2可增強針對多種癌癥模型的接受性T細胞免疫療法

       改造T細胞表達嵌合抗原受體（CAR）或T細胞受體（TCR），使其能夠特異性識別并攻擊癌細胞的方法，已成為血液系統(tǒng)惡性腫瘤的重要治療手段。EZH2是一種組蛋白甲基轉移酶，通過催化H3K27me3來抑制基因表達，在多種癌癥中發(fā)揮促癌作用，并與免疫逃逸相關。EZH2抑制劑（tazemetostat）和EZH1/2雙重抑制劑（valemetostat）已在臨床試驗中顯示出單藥抗腫瘤活性。作者探討了EZH1/2抑制劑在多種癌癥模型中對CAR-T和TCR-T細胞免疫療法的增強作用，發(fā)現(xiàn)EZH2抑制劑通過重編程腫瘤細胞的免疫原性，上調炎癥相關基因和T細胞趨化因子，顯著增強了CAR-T細胞的激活、增殖和腫瘤浸潤能力，從而提高了抗腫瘤效果。此外，EZH1/2雙重抑制劑在某些癌癥模型中比單一EZH2抑制劑表現(xiàn)出更強的療效，提示其在克服腫瘤耐藥性方面具有潛在優(yōu)勢?？傊?，作者研究了EZH1/2抑制劑對多種癌癥模型中CAR-T和TCR-T細胞免疫療法的增強作用，揭示了EZH2抑制劑通過重編程腫瘤細胞的免疫原性，顯著提高免疫療法的療效，并為克服腫瘤耐藥性提供了新的策略。該研究于2025年2月發(fā)表在《Cancer Cell》，IF 48.8分。

技術路線：

主要研究結果：

1人類B細胞淋巴瘤模型中EZH2抑制改善了CAR-T細胞的抗腫瘤效果

       作者首先探索了EZH2抑制劑tazemetostat增強CART19免疫療法的潛力，因為這兩種療法均被批準用于依賴EZH2生存的GC B細胞淋巴瘤。為此，作者選擇了四種GC來源的DLBCL淋巴瘤細胞系（OCI-Ly18和Toledo為野生型EZH2，SU-DHL-4和Karpas-422為突變型EZH2）。使用亞治療劑量的tazemetostat（OCI-Ly18、Toledo、SU-DHL-4為500 nM；Karpas-422為50 nM），在不影響細胞短期（≤3天）活力和增殖的情況下耗竭了H3K27ME3，從而能夠評估其與CART19療法的潛在聯(lián)合效果。為了確定最有效的給藥序列，作者測試了五種tazemetostat和CAR-T的不同給藥順序（圖1B）。最有效的方案（方案#1）包括預先用tazemetostat處理腫瘤細胞，并在CART19給藥后繼續(xù)暴露于tazemetostat（圖1C）。在該方案下，tazemetostat增強了CART19介導的對GC來源DLBCL細胞系的殺傷效果，并且這種增強作用與細胞的EZH2突變狀態(tài)無關。值得注意的是，tazemetostat還改善了對單藥CART19耐藥的Karpas-422細胞系的殺傷效果（圖1C）。這一發(fā)現(xiàn)強調了在CAR-T抗腫瘤效應期間，需要對腫瘤細胞進行預處理并維持EZH2抑制。單獨使用tazemetostat可降低H3K27me3水平（圖S2A），但在這些劑量下對短期淋巴瘤生長無顯著影響（圖S2B）。除非另有說明，后續(xù)所有體外實驗均采用方案#1作為標準給藥方案。為了從遺傳學角度確認這些發(fā)現(xiàn)，作者通過短發(fā)夾RNA在SU-DHL-4細胞（突變型EZH2）中建立了EZH2敲低（KD）模型（圖1D）。與小分子抑制結果一致，EZH2 KD增強了CART19介導的殺傷效果（圖1D）。隨后，作者利用對CART19高度耐藥的EZH2野生型DLBCL細胞系OCI-Ly18建立了異種移植模型來驗證這些結果（圖1E）。將OCI-Ly18細胞皮下植入免疫缺陷的NSG小鼠后，隨機分為接受tazemetostat（200 mg/kg/天，持續(xù)約7周，口服）或對照溶劑處理的組，隨后給予亞治療劑量的CART19（3.5×10?細胞/只小鼠，靜脈注射）或未轉導（UTD）細胞。與單獨使用CART19或tazemetostat相比，tazemetostat聯(lián)合CART19顯著改善了腫瘤控制（圖1F和S2C），并延長了小鼠的生存時間（圖1G）。Tazemetostat對T細胞無毒性，并且未觀察到顯著的治療相關毒性（體重減輕或移植物抗宿主病[GVHD]；圖S2D）。相反，在第20天，接受tazemetostat治療的小鼠血液中CART19細胞水平顯著增加（圖1H）。

圖1：EZH2抑制使淋巴瘤細胞對CART19療法敏感

2 EZH2抑制增強淋巴瘤的免疫原性

       為了探究EZH2抑制如何增強CAR-T細胞的療效，作者首先關注其對癌細胞的影響。作者對經過tazemetostat或對照溶劑預處理3天的GFP? OCI-Ly18和SU-DHL-4細胞（分別為野生型和突變型EZH2）進行了RNA測序，隨后將這些細胞暴露于tazemetostat和未轉導（UTD）或CART19細胞共培養(yǎng)48小時（方案#1）。差異表達基因（DEGs）分析顯示，單獨使用tazemetostat誘導的DEGs數(shù)量最多，且主要為上調基因，這與EZH2的抑制性作用一致（圖S3B和S3C）。對僅暴露于CART19的腫瘤細胞進行基因集富集分析（GSEA）確認了CART19介導殺傷的關鍵機制，包括干擾素-γ/α、通過核因子κB（NF-κB）的腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素（IL）-2-STAT5信號通路以及凋亡（圖S3D）。接受tazemetostat處理的組（Taz-UTD和Taz-CART19）表現(xiàn)出細胞周期和增殖相關基因（例如MYC靶基因、G2M檢查點和E2F靶基因）的下調。暴露于Taz-CART19的腫瘤細胞特異性上調了與炎癥（IL2RA）、B細胞激活/分化（例如KDM5B和BACH2）、黏附（例如OX40L/TNFSF4和CD80）、T細胞趨化（例如CXCL9、CXCL10和CXCL16）以及運動性（例如LMNA、CEACAM1、NRCAM和EPHB2；圖2A）相關的基因。

       為了進一步探索EZH2抑制在體內的效應，作者采用了對CART19耐藥的OCI-Ly18異種移植淋巴瘤模型（圖2B）。在該模型中，OCI-Ly18細胞在第-18天皮下植入NSG小鼠，從第-15天開始給予tazemetostat（150 mg/kg/天，口服）或對照溶劑處理；在第0天給予CART19（4.0×10? CAR-T?細胞/只小鼠，靜脈注射）或未轉導（UTD）細胞。這一時間表允許tazemetostat對腫瘤進行更長時間的預處理和重編程。在CART輸注后第11天，在CART19組之間尚未出現(xiàn)顯著腫瘤大小差異之前，將腫瘤取出并進行分析（圖2C）。在顯微鏡下評估時，與對照組相比，接受CART19和tazemetostat治療的小鼠腫瘤更小、壞死更多，并且T細胞浸潤增加（圖2D）。對分選的腫瘤細胞進行差異基因表達分析顯示，EZH2抑制增加了MHC-I/II抗原（HLA-A、HLA-DOA和HLA-DOB）、共刺激分子（CXCL9、CXCL10和CD40）、黏附（ICAM1）、B細胞激活（FOS和JUN）、干擾素（IFN）反應（STAT1-3和IRF2/7/9）以及p53介導的凋亡（FAS、ATF3、CASP3/4/7、MCL1和MDM2；圖2E）相關基因的表達。這些發(fā)現(xiàn)表明，EZH2抑制重塑了腫瘤的免疫原性，并調節(jié)了炎癥和凋亡通路，可能增強了腫瘤細胞與CAR-T細胞之間的相互作用，最終有助于提高CAR-T的療效。

       為了評估EZH2抑制在染色質水平上的效應，作者對經過tazemetostat或對照溶劑預處理3天的突變型EZH2 SU-DHL-4細胞進行了ATAC測序，隨后將這些細胞暴露于tazemetostat和UTD或CART19細胞共培養(yǎng)48小時（方案#1）。

       最后，作者通過流式細胞術定量檢測了經72小時處理后腫瘤細胞表面的CD19水平，以探究tazemetostat暴露后的蛋白變化。結果顯示，EZH2抑制并未改變CD19的表達（圖S3G）。然而，已知的EZH2靶基因CD58在經tazemetostat處理的淋巴瘤細胞中上調，這一結果通過流式細胞術得到了驗證（圖S3H）。最后，為了功能驗證EZH2抑制主要通過增強腫瘤細胞與CAR-T細胞之間的相互作用來提高殺傷效果的假設，作者利用z-Movi平臺（LUMICKS）檢測了CART19細胞與腫瘤細胞之間的親和力（avidity）。親和力受多種因素影響，包括CAR的親和力、黏附分子和共刺激蛋白，它決定了T細胞與靶細胞界面的相互作用強度，影響CAR信號傳導、細胞因子分泌、增殖和持久性。事實上，tazemetostat預處理提高了CART19細胞對OCI-Ly18和SU-DHL-4細胞的親和力，表明結合效率增強（圖2F）。這一結果進一步在通過shRNA敲低EZH2的SU-DHL-4細胞中得到驗證，從而強化了EZH2抑制在增強腫瘤細胞與CAR-T細胞相互作用中的作用（圖2F）。

圖2：EZH2抑制調節(jié)淋巴瘤的免疫原性

3 EZH2抑制改善CAR-T細胞在遇到腫瘤時的擴增和激活

       EZH2也在T細胞中表達，它調節(jié)T細胞的激活、增殖和分化，同時抑制促炎細胞因子。因此，作者研究了EZH2抑制對CAR-T細胞的影響。在持續(xù)信號傳導的CAR-T模型中，EZH2抑制可以防止CAR-T細胞耗竭后的恢復。還有研究表明，在小鼠（GC）淋巴瘤和黑色素瘤模型中，預先用tazemetostat處理的過繼轉移T細胞顯示出更強的抗腫瘤活性。

       作者首先研究了在腫瘤細胞預先用tazemetostat處理后，CAR-T細胞和腫瘤細胞在殺傷實驗中同時暴露于藥物（方案#1）時，tazemetostat對CAR-T細胞的影響。首先，作者評估了tazemetostat對CART19激活、長期腫瘤控制、擴增和記憶形成的影響。體外實驗中，tazemetostat顯著增加了CAR-T細胞的細胞因子分泌（IFN-γ、TNF和IL-2），增強了長期殺傷能力，并促進了與預先用tazemetostat處理的腫瘤細胞共培養(yǎng)時的擴增。此外，流式細胞術分析顯示，經tazemetostat處理的CART19細胞中效應記憶亞群的比例增加。相反，僅將CAR-T細胞暴露于tazemetostat并未導致功能增強，如之前所示。為了評估CAR-T細胞隨時間的功能變化，作者進行了再挑戰(zhàn)實驗。在此實驗中，CART19細胞與SU-DHL-4細胞共培養(yǎng)，后者要么未處理，要么預先用tazemetostat處理。未處理的腫瘤細胞在第4天、第7天和第11天重新引入，以觸發(fā)CAR-T細胞功能障礙。值得注意的是，在此模型中，與單獨使用CART19相比，聯(lián)合使用tazemetostat的CART19在維持長期細胞毒性活性和擴增方面表現(xiàn)出更高的能力，而單獨的CART19則顯示出殺傷能力減弱和增殖能力較差。

       基于tazemetostat通過腫瘤重編程增強CART19療效的發(fā)現(xiàn)，作者進一步研究了體內腫瘤浸潤性CART19細胞的特征。在CART19輸注前15天，用亞治療劑量的tazemetostat或對照溶劑預處理腫瘤，以實現(xiàn)通過EZH2抑制對腫瘤細胞的重編程，并在CART19輸注后第11天對腫瘤浸潤性T細胞進行單細胞RNA測序（scRNA-seq）。tazemetostat處理的腫瘤表現(xiàn)出更高的T細胞浸潤，并且基于轉錄特征的UMAP分析揭示了七個不同的T細胞亞群，包括富含細胞毒性（例如IFNG和GZMB）和細胞周期（TOP2A和PCNA）標記物的簇。在兩組中，腫瘤浸潤性T細胞均表現(xiàn)出高水平的CD8A表達，表明細胞毒性T細胞在腫瘤微環(huán)境（TME）中占主導地位。對tazemetostat處理的腫瘤中的CART19細胞進行基因集富集分析（GSEA）顯示，激活和細胞毒性基因（例如GZMB、PRF1、IFNG和CD69）上調，而耗竭標記物（例如LAIR2）下調，與對照組相比（圖3F）。這些發(fā)現(xiàn)表明，EZH2抑制增強了T細胞的浸潤，并促進了腫瘤內CART19細胞的腫瘤反應性和細胞毒性表型。

       為了進一步研究EZH2抑制對血液中CART19細胞的影響，作者使用最初的模型分析了外周血中的循環(huán)CART19細胞，在該模型中，tazemetostat和CART19的聯(lián)合使用改善了腫瘤控制并延長了生存期。在接受tazemetostat治療的小鼠中觀察到CART19細胞的擴增增加。在單細胞RNA測序中，UMAP分析顯示了七個具有不同特征的簇。CD8A表達在簇3中占主導地位，而其他簇則以CD4表達為特征。簇1和簇2在tazemetostat處理的小鼠中更為豐富，富含與激活的幼稚/早期記憶狀態(tài)、效應功能、抗凋亡和糖酵解相關的基因。相比之下，簇0和簇4在對照溶劑處理的小鼠中更為常見，表達與終末效應表型和轉化生長因子β（TGF-β）/Smad3通路相關的基因，該通路抑制CD4 T細胞的增殖和共刺激（圖3G）。這些發(fā)現(xiàn)表明，在tazemetostat存在的情況下，腫瘤部位的CART19細胞表現(xiàn)出效應表型，而循環(huán)的CD4? T細胞則保持更幼稚/早期記憶的狀態(tài)，這與增加的持久性一致。

       最后，作者直接且單獨研究了tazemetostat對CAR-T細胞的影響。首先，作者測量了在照射的OCI-Ly18細胞層上培養(yǎng)的CAR-T細胞在不同濃度tazemetostat下的增殖情況。在這種情況下，EZH2抑制并未影響CART19細胞的增殖。此外，如之前所示，包括CAR-T細胞預先暴露于tazemetostat的治療方案#4和#5并未顯著改善CAR-T細胞的功能。進一步地，在CART19制造過程中加入tazemetostat并未影響CART19細胞的活性、擴增或殺傷能力。然后，作者使用CRISPR-Cas9技術生成了EZH2敲除（EZH2-KO）的CART19細胞。值得注意的是，與野生型CART19細胞相比，EZH2-KO的CART19細胞在體外顯示出相當?shù)臍芰?。此外，?span>SU-DHL-4細胞預先用tazemetostat處理后，暴露于野生型或EZH2-KO的CART19細胞（方案#1）時，tazemetostat仍然以類似的方式增強了兩組的細胞毒性活性。

       綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明，tazemetostat通過EZH2抑制對腫瘤細胞的主要益處是重塑它們的免疫原性，從而促進CART19細胞的更好激活。然而，EZH2抑制并未削弱CAR-T細胞的抗腫瘤效果。

圖3：EZH2抑制增強了CART19的細胞毒性并誘導更幼稚/早期記憶表型

4 EZH2和EZH1/EZH2抑制劑增強CAR-T細胞和TCR T細胞療法對多種液體和實體腫瘤的抗腫瘤效果

       鑒于EZH2失調在液體和實體癌癥中均有明確的作用，作者試圖探索EZH2抑制是否能夠廣泛增強多種CAR-T產品的CAR-T免疫療法的效果。令人驚訝的是，EZH2抑制顯著改善了模型中的CAR-T介導的殺傷效果（序列#1，圖4A）。在血液惡性腫瘤中，EZH2是多發(fā)性骨髓瘤（MM）進展的關鍵驅動因素，導致細胞周期失控、抗凋亡以及MM細胞的侵襲性行為。為了評估EZH2抑制是否能夠增強針對MM的CAR-T療法的效果，作者測試了tazemetatost與抗BCMA CAR-T細胞的聯(lián)合應用。值得注意的是，EZH2抑制顯著增強了抗BCMA CAR-T細胞的長期殺傷能力（序列#1，圖4B）。

       由于EZH2在急性髓系白血?。?span>AML）細胞分化中發(fā)揮作用，并且能夠增強對其他療法的敏感性，作者還在AML（KG-1和THP-1）中評估了抗CD33 CAR-T細胞與EZH2抑制劑的聯(lián)合應用。在這一模型中，EZH2抑制也導致了CAR-T細胞體外殺傷能力的增強（序列#1，圖4C）。這些發(fā)現(xiàn)共同強調了EZH2抑制在廣泛增強多種血液惡性腫瘤CAR-T療法中的潛力。

       為了評估EZH2抑制在血液癌癥CAR-T免疫療法之外的潛在影響，作者研究了在已知依賴EZH2的實體腫瘤中EZH2抑制的效果，例如HER2+卵巢癌、前列腺癌和肉瘤。癌細胞（SKOV-3和PC3）預先用tazemetostat處理，并在HER2靶向CAR-T細胞介導的殺傷過程中繼續(xù)使用該藥物（序列#1），作者觀察到CAR-T細胞殺傷能力在長期顯著增強（圖4D）。此外，鑒于tazemetostat已獲得FDA批準用于上皮樣肉瘤，作者將研究擴展到A673肉瘤細胞系，并構建了帶有抗HLA-A*02:01-LOXHD1 TCR抗原的TCR T細胞。在這一模型中，tazemetostat顯著增強了TCR T細胞對癌細胞的殺傷效果（圖4E）。因此，EZH2抑制在多種實體腫瘤和多樣化的過繼T細胞免疫療法中顯示出廣闊的前景。

       作者假設，由于EZH1在EZH2被抑制時的代償作用以及EZH1在非增殖細胞中的表達，將EZH1與EZH2抑制相結合可以進一步增強CAR-T療法的效果。作者選擇了valemetostat的次優(yōu)劑量，并觀察到它顯著增強了CART19對腫瘤的殺傷效果（圖4F）。在各種valemetostat和CART19給藥方案（序列#1-#5；圖4F）中，預先孵育腫瘤細胞并持續(xù)藥物存在是最有效的方案（圖4F，序列#1）。與單一抑制劑tazemetostat不同，同時將CART19/Val給予腫瘤細胞顯示出增加殺傷，的趨勢而預先用valemetostat孵育CART19細胞，隨后在殺傷過程中持續(xù)治療（序列#5）增強了抗腫瘤效果，表明雙重EZH1/EZH2抑制比單獨抑制EZH2對腫瘤和T細胞具有更大和更快的效果。作者評估了valemetostat對CART19連續(xù)殺傷效率和抗耗竭能力的影響。在再挑戰(zhàn)實驗中，CART19細胞與SUDHL-4細胞共同培養(yǎng)，后者要么未處理，要么預先用valemetostat處理。在4、7和11天的間隔后重新引入未處理的腫瘤細胞，以評估CART19細胞隨時間的細胞毒性。在存在valemetostat的情況下，CART19細胞的殺傷效果在初始和持續(xù)腫瘤殺傷方面均優(yōu)于對照組，顯示出增強的細胞毒性，且未損害持續(xù)細胞毒性潛力（圖4G）。

       為了評估雙重EZH1/EZH2抑制對其他CAR-T產品和疾病的影響，作者測試了valemetostat與抗BCMA CAR-T細胞聯(lián)合應用于多發(fā)性骨髓瘤細胞系RPMI-8226。次優(yōu)劑量的valemetostat能夠顯著增強CARTBCMA細胞的長期殺傷效率（圖4H）。作者建立了一個RPMI-8226的骨內原位異種移植模型。在骨內腫瘤植入后3天，小鼠開始接受valemetostat（100 mg/kg，口服，每天一次，持續(xù)5周）或載體。在RPMI-8226植入后1周，小鼠被隨機分配接受CARTBCMA（0.8×10^6/只小鼠，靜脈注射）。在這個模型中，持續(xù)給予valemetostat改善了CARTBCMA對腫瘤的控制，促進了血液中T細胞的擴增，并且沒有顯著的治療相關毒性（體重減輕或GVHD）（圖4I、4J）。此外，接受CARTBCMA/valemetostat聯(lián)合治療的動物顯示出細胞毒性細胞因子IFN-γ的血清水平升高，表明T細胞的激活和細胞毒性反應增強（圖4K）。

       總之，作者研究了EZH2/EZH1抑制在多種人類癌癥的臨床前模型中的作用，這些模型接受了過繼細胞療法。在所有測試的模型中，EZH2/EZH1抑制均增強了CAR和TCR-T的抗腫瘤效果。在淋巴瘤模型中，EZH2抑制調節(jié)了淋巴瘤細胞的免疫原性，使其更具免疫原性，并更有效地激活CAR-T細胞。

圖4：EZH2及EZH1/EZH2抑制使血液腫瘤和實體腫瘤模型對免疫療法產生敏感性

結論：

       綜上所述，在這項研究中，作者證明了抑制EZH2或同時抑制EZH1/EZH2能夠顯著增強CAR-T和TCR-T細胞過繼免疫療法在多種癌癥模型中的抗腫瘤效果，這些模型包括液體腫瘤和實體腫瘤。作者的研究揭示了一種通過使用EZH1/EZH2抑制劑來增強過繼T細胞療法的方法。此外，該研究還為EZH2以及EZH1/EZH2在免疫治療過程中調節(jié)腫瘤細胞和T細胞的作用機制提供了見解。

實驗方法：

       皮下或原位移植瘤模型，RNA-seq，scRNA-seq，ATAC-seq，細胞培養(yǎng)，WB，ELISA，免疫熒光，流式

參考文獻：

       Porazzi P, Nason S, Yang Z, Carturan A, Ghilardi G, Guruprasad P, Patel RP, Tan M, Padmanabhan AA, Lemoine J, Fardella E, Zhang Y, Pajarillo R, Chen L, Ugwuanyi O, Markowitz K, Delman D, Angelos MG, Shestova O, Isshiki Y, Blanchard T, Béguelin W, Melnick AM, Linette GP, Beatty GL, Carreno BM, Cohen I, Paruzzo L, Schuster SJ, Ruella M. EZH1/EZH2 inhibition enhances adoptive T cell immunotherapy against multiple cancer models. Cancer Cell. 2025 Feb 20:S1535-6108(25)00031-5. doi: 10.1016/j.ccell.2025.01.013IF: 48.8 Q1 . Epub ahead of print. PMID: 39983725.