多維單細(xì)胞蛋白和RNA分析 剖析胸腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞和功能異質(zhì)性
胸腺間質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)提供了控制T細(xì)胞發(fā)育和選擇的必要環(huán)境，并提供獨(dú)特的分子信號(hào)。最近的單細(xì)胞RNA測(cè)序研究揭示了胸腺上皮細(xì)胞（TEC）之間存在先前未被充分認(rèn)識(shí)的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性。然而，只有極少數(shù)細(xì)胞標(biāo)記物能夠?qū)EC進(jìn)行可比較的表型鑒定。在本研究中，我們利用大規(guī)模并行流式細(xì)胞術(shù)和機(jī)器學(xué)習(xí)將已知的TEC表型解構(gòu)為新的亞群。利用CITE-seq技術(shù)，將這些表型與細(xì)胞的RNA譜進(jìn)行關(guān)聯(lián)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)相應(yīng)的TEC亞型的表型鑒定。這種方法允許表型鑒定圍產(chǎn)期cTEC并確定其在皮質(zhì)基質(zhì)框架中的物理定位。此外，我們展示了圍產(chǎn)期cTEC在響應(yīng)發(fā)育中的胸腺細(xì)胞時(shí)比例的動(dòng)態(tài)變化，并揭示了它們?cè)陉栃赃x擇中的非凡效率。總的來說，我們的研究確定了一些標(biāo)記物，使我們能夠解析胸腺間質(zhì)的復(fù)雜性，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了TEC亞群的物理分離，并將特定功能歸屬于個(gè)體TEC亞型。
該研究于2023年7月發(fā)表在《Nature Communications》，IF：16.6。
技術(shù)路線
結(jié)論
1、跨胸腺基質(zhì)細(xì)胞亞群的細(xì)胞表面表達(dá)圖譜的建立
為了在表型水平上解析胸腺間質(zhì)的異質(zhì)性，我們?cè)噲D確定可靠準(zhǔn)確地識(shí)別TEC亞群的新的細(xì)胞表面標(biāo)記物，這些亞群之前只通過細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行定義。為此，我們使用大規(guī)模并行流式細(xì)胞術(shù)對(duì)260個(gè)單個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行染色，并采用Infinity Flow這種計(jì)算機(jī)機(jī)器學(xué)習(xí)算法進(jìn)行分析。胸腺基質(zhì)細(xì)胞從1周、4周和16周的小鼠中分離為單個(gè)細(xì)胞，然后進(jìn)行物理富集，并隨后用12個(gè)骨干標(biāo)記物染色，這些標(biāo)記物要么單獨(dú)，要么組合在一起可可靠地識(shí)別出血細(xì)胞造血細(xì)胞（CD45），不同的上皮細(xì)胞（EpCAM1，Ly51，UEA1，MHCII，CD40，CD80，CD86，Sca1，AIRE，Podoplanin），內(nèi)皮細(xì)胞（CD31）和一些間質(zhì)細(xì)胞（Sca1，Ly51，Podoplanin）（圖1a）。下一步，將細(xì)胞分成若干等分，并分別對(duì)260個(gè)探索性標(biāo)記物進(jìn)行染色。在樣本獲取后，使用Infinity Flow在單個(gè)細(xì)胞分辨率上預(yù)測(cè)每個(gè)探索性標(biāo)記物的表達(dá)水平。所得到的表達(dá)預(yù)測(cè)基于記錄的骨干標(biāo)記物的非線性函數(shù)。單細(xì)胞分析流程Seurat進(jìn)一步分析和可視化觀察到的異質(zhì)性和共表達(dá)模式。數(shù)據(jù)的分層聚類結(jié)果顯示，從1周大的小鼠中獲得的數(shù)據(jù)產(chǎn)生了7個(gè)簇，而來自較年長(zhǎng)動(dòng)物的數(shù)據(jù)產(chǎn)生了10個(gè)簇，通過統(tǒng)一的流形近似投影（UMAP）在二維平面上呈現(xiàn)。
在三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，可以根據(jù)關(guān)鍵標(biāo)記物的表達(dá)可靠地識(shí)別主要胸腺基質(zhì)細(xì)胞類型、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、周皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，包括識(shí)別 TEC 的 EpCAM1 (CD326)、標(biāo)記成纖維細(xì)胞的 CD140a、Ly51 和CD146 挑出周皮細(xì)胞，CD31 染色內(nèi)皮細(xì)胞。其他標(biāo)記識(shí)別了這些細(xì)胞簇內(nèi)的亞群。選定的 260 個(gè)探索性標(biāo)記中還包含一些用于檢測(cè)骨干表位的抗體特異性，這允許在探索性標(biāo)記和相同主要標(biāo)記之間進(jìn)行直接比較，從而驗(yàn)證 Infinity Flow 算法的實(shí)用性。
初始表達(dá)分析不僅通過流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)了胸腺基質(zhì)細(xì)胞類型之間的異質(zhì)性，而且還揭示了各個(gè) TEC 亞群的相對(duì)代表性隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化。在第二次分析中，我們專門關(guān)注 EpCAM1+ 細(xì)胞，并在 1 周齡非老年小鼠中公開了三個(gè)獨(dú)立的 cTEC 亞群（由細(xì)胞的 Ly51 和 UEA1 差異表達(dá)定義），從而說明早期 cTEC 群體具有更大的異質(zhì)性。壽命在 4 周齡及以上的小鼠中，具有低表面 MHCII 表達(dá)的 mTEC（稱為 mTEClo）根據(jù)分析的表面標(biāo)記的差異表達(dá)分為 4 個(gè)獨(dú)立的亞簇（圖 1b-d）。
圖1 Infinity Flow分析揭示TEC異質(zhì)性
2、通過差異細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)鑒定 cTEC 異質(zhì)性
我們接下來查看CD83、CD40、hvem(CD270)和Ly51的表達(dá)是否明確地對(duì)單個(gè)cTEC亞群進(jìn)行了分類，因?yàn)樗鼈冊(cè)?周齡小鼠中發(fā)現(xiàn)的cTEC簇的強(qiáng)度分布不同(圖2a)。CD40和hvem的表達(dá)僅限于指定為cTEC I的亞群(見下文)，而另外兩個(gè)標(biāo)記在所有cTEC亞群中都被檢測(cè)到，但在cTEC I上有更強(qiáng)的信號(hào)(圖2a)。
分析先前發(fā)表的TEC13的scRNA-seq數(shù)據(jù)集，在圍產(chǎn)期cTEC中檢測(cè)到CD83、CD40和Enpep(編碼Ly51)的轉(zhuǎn)錄本，盡管在不同的水平上(圖2b，c)。相反，編碼HVEM的基因Tnfrsf14的轉(zhuǎn)錄本只在幾個(gè)TEC中檢測(cè)到，但在幾個(gè)簇中檢測(cè)到，因此未能明確識(shí)別圍產(chǎn)期cTEC。這一發(fā)現(xiàn)突顯了基因表達(dá)研究在識(shí)別與細(xì)胞RNA圖譜匹配的表面標(biāo)記方面的局限性。為了進(jìn)一步評(píng)估cTEC I亞簇與scRNA-seq確定的TEC亞型的關(guān)系，我們用SingleR軟件生成了一個(gè)相似性分?jǐn)?shù)，它將單個(gè)細(xì)胞的RNA表達(dá)譜與計(jì)算出的cTEC I細(xì)胞表面表達(dá)模式聯(lián)系起來。這一分析表明，cTEC I與圍產(chǎn)期cTEC配對(duì)的相似性分?jǐn)?shù)最高(圖2D)。
然后，我們的目標(biāo)是定義允許通過流式細(xì)胞術(shù)分離圍產(chǎn)期cTEC的表面標(biāo)志物。我們使用了1周齡小鼠的cTEC I簇中高表達(dá)的標(biāo)記，同時(shí)排除了從4到16周齡動(dòng)物分離的大多數(shù)成熟cTEC上檢測(cè)到的標(biāo)記(圖1b-d；2a)，因?yàn)槔夏陝?dòng)物中的皮質(zhì)上皮群只含有比例非常低的圍產(chǎn)期cTEC。在cTEC群體中，我們發(fā)現(xiàn)了一組同時(shí)表達(dá)CD83和CD40但在出生后早期Sca1陰性的細(xì)胞亞群(圖2e)。CD83+CD40+Sca1?上皮細(xì)胞的比例在整個(gè)生命過程中發(fā)生了實(shí)質(zhì)性的變化，隨著細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)在器官發(fā)生過程中逐漸增加，在1周齡的小鼠中穩(wěn)定在(4.6×104±1.4萬個(gè)細(xì)胞)，隨后下降，在8周齡的動(dòng)物中表現(xiàn)出最低的表達(dá)(2.4×103±2.3x103個(gè)細(xì)胞；圖2e，f)。
圍產(chǎn)期cTEC與其他cTEC亞群(包括cTEC簇II和III)相比，Hvem、Ly51和MHCII的細(xì)胞表面水平較高，這使得在沒有Sca1的情況下，這些細(xì)胞通過CD83和CD40的高表達(dá)得以鑒定。圍產(chǎn)期cTEC也顯示出較高的Foxn1啟動(dòng)子活性，如在報(bào)告小鼠中所證明的那樣，GFP的表達(dá)受Foxn1基因座的轉(zhuǎn)錄控制(圖2g)。
圖2 圍產(chǎn)期cTEC的表面表達(dá)譜
3、典型和簇狀TEC的鑒定
對(duì)成年小鼠的Infinity Flow分析顯示出4個(gè)明顯的mTEClo簇。簇I和II在4周和16周的小鼠中觀察到，并且對(duì)于大多數(shù)260個(gè)探索性標(biāo)記物（圖1b-d）顯示出相似的表達(dá)譜，包括Sca1和CD146的共同表達(dá)（圖3a，b）。為了將這兩個(gè)表型定義的亞群與它們對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組確定的TEC亞型相匹配，我們對(duì)單個(gè)TEC的RNA譜進(jìn)行了檢測(cè)，以確定Ly6a / Ly6e（編碼Sca1）和Mcam（編碼CD146）的表達(dá)情況。雖然Ly6a / Ly6e的轉(zhuǎn)錄本尤其在亞型TEC中被檢測(cè)到，但Mcam特異性RNA僅在不同的TEC中以低水平檢測(cè)到，但主要在亞型TEC中檢測(cè)到（圖3c）。這種亞型的轉(zhuǎn)錄特征特征是cTEC和mTEC的特征，正如傳統(tǒng)表面標(biāo)記物L(fēng)y51和UEA反應(yīng)性所定義的表型一樣，這些特征貢獻(xiàn)于這種獨(dú)特的TEC亞型。再次使用SingleR軟件包，計(jì)算了4周和16周mTEClo I和II與亞型TEC之間的相似度得分最高（圖3d）。mTEClo亞群包含共表達(dá)Sca1和CD146的細(xì)胞，而且這種表型的細(xì)胞隨著出生后的年齡增長(zhǎng)而增加（圖3e，f）。盡管最初只在mTEClo中檢測(cè)到，但這個(gè)亞群在4周以上的小鼠的cTEC區(qū)域中也越來越多地觀察到（圖3e，f）。
沒有找到一組專門識(shí)別mTEClo簇III的獨(dú)特的表面標(biāo)記。然而，在沒有Sca1和CD63陽性的情況下同時(shí)表達(dá)CD66a和CD117確定了mTEClo簇IV。這個(gè)簇只在成年小鼠中檢測(cè)到(圖4a)，盡管在1周齡動(dòng)物的mTEClo簇II中也可以檢測(cè)到定義的4個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記。因此，1周齡小鼠的mTEClo II簇可能代表了在老年動(dòng)物中形成單獨(dú)簇mTEClo IV的上皮細(xì)胞。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄分析僅部分符合mTEClo簇的表型分析，因?yàn)樵诮^大多數(shù)TEC中確實(shí)可以檢測(cè)到Ly6a/Ly6e和CD63特異的RNA(圖3c和4b)，而這些細(xì)胞中大部分缺乏Ceacam1(編碼CD66a)和Kit(編碼CD117)的轉(zhuǎn)錄本(圖4b)。相似性得分顯示mTEClo簇IV與AIRE后和簇狀mTEC之間的最佳匹配(圖4c)。
接下來，我們?cè)噲D定義屬于mTEClo IV簇的細(xì)胞的表型特征，以允許通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行物理分離。為此，我們?cè)赟ca1-CD63-mTEClo中鑒定了CD66a和CD117陽性的細(xì)胞亞群，從而反映了mTEClo簇IV(圖4d)的特征。大部分Sca1-CD63-CD66a+CD117+mTEClo細(xì)胞(~70%)也表達(dá)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Dclk1(圖4e)，它是簇狀mTEC的典型細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志。雖然簇狀mTEC標(biāo)記L1CAM在我們手中的染色不成功，但Dclk1陰性和陽性部分都具有先前描述的CD104lo簇狀mTEC表型。此外，簇狀mTEC中Dclk1陰性細(xì)胞的存在得到了先前scRNA-seq結(jié)果的支持。我們還觀察到，Sca1-CD63-CD66a+CD117+mTEClo中Dclk1的缺失與CD66a和CD117的表面表達(dá)降低相關(guān)，表明這些細(xì)胞尚未完全分化為簇狀mTEC。相反，絕大多數(shù)Dclk1陽性的TEC在Sca1-CD63-CD66a+CD117+mTEClo中檢測(cè)到。在沒有轉(zhuǎn)錄因子Pou2f3Dclk1的情況下，Sca1-CD63-CD66a+CD117+mTEClo細(xì)胞沒有表達(dá)(圖4f，g)，從而證實(shí)它們是簇狀胸腺上皮細(xì)胞。利用這些表型特征，我們注意到4周齡小鼠中簇狀mTEC的存在以最高的比例和細(xì)胞密度隨時(shí)間變化(圖4H，I)。由于CD66a-CD117-細(xì)胞(“非簇狀”)在相對(duì)較少的Sca1?CD63?mTEClo中占相當(dāng)大的比例(在4周時(shí)約為40%)，我們?cè)噲D通過Bulk RNA-seq進(jìn)一步確定它們的身份。具體地說，我們調(diào)查了這些細(xì)胞是否具有簇狀mTEC的轉(zhuǎn)錄特征。這一分析揭示了非簇狀細(xì)胞和簇狀細(xì)胞之間的主要轉(zhuǎn)錄差異。與簇狀細(xì)胞相關(guān)的基因在細(xì)胞的CD66a+CD117+部分中得到富集，包括Dclk1、Il25、Ceacam1和Kit。同樣，在先前的scRNA-seq實(shí)驗(yàn)中確定的定義簇狀mTEC的top基因在這些簇狀細(xì)胞中表達(dá)水平非常高，而它們的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在非簇狀細(xì)胞中不存在。將整個(gè)非簇狀轉(zhuǎn)錄組與注釋的TEC亞集的相關(guān)性證實(shí)了從被鑒定為簇狀mTEC的細(xì)胞。由于CD66a-CD117-非簇狀mTEC的基因表達(dá)譜與任何已知的mTEC亞群都不匹配，因此這些稀有細(xì)胞(約占總TEC的4%)可能代表mTEC亞群的混合。
簇狀mTEC起源于曾經(jīng)表達(dá)組織限制性抗原Csnb15的mTEC。我們利用CsnbCre::Rosa26LSL-YFP報(bào)告基因來測(cè)試Sca1-CD63-CD66a+CD117+mTEClo是否表達(dá)Csnb的前體。與先前的研究一致，我們鑒定了Sca1-CD63-CD66a+CD117+mTEClo mTEC的70-80%帶有YFP標(biāo)記，這表明它們代表真正的簇狀mTEC。MTEClo細(xì)胞由尚未表達(dá)轉(zhuǎn)錄促進(jìn)劑AIRE的髓質(zhì)上皮細(xì)胞組成，或者屬于一組已經(jīng)從AIRE陽性的成熟mTEC分化而來的細(xì)胞。此前已證明簇狀mTEC至少部分來源于AIRE陽性前體，并富含表面糖蛋白Tspan8的表達(dá)，Tspan8是AIRE增強(qiáng)的組織限制性抗原。因此，我們測(cè)試了Sca1-CD63-CD66a+CD117+mTEClo(即絨毛狀)mTEC表達(dá)Tspan8陽性。多達(dá)60%的簇狀mTEC表達(dá)Tspan8，進(jìn)一步證實(shí)了它們的身份，并確定這些細(xì)胞含有AIRE后的mTEC。YFP和Tspan8僅在Sca1+CD146+mTEClo典型TEC的一小部分中聯(lián)合表達(dá)，表明它們屬于TEC發(fā)育階段，尚未混雜表達(dá)組織特異性抗原。
圖3 確定cTEC和mTEC中的典型TEC
圖4 定義簇狀mTEC的表面標(biāo)記組合
4、CITE-seq驗(yàn)證新的TEC標(biāo)記
接下來，我們使用CITE-seq同時(shí)測(cè)定了單個(gè)胸腺基質(zhì)細(xì)胞表面蛋白和mRNA表達(dá)的豐度。這一方法也被用來明確地證明可以結(jié)合使用新描述的細(xì)胞表面標(biāo)記識(shí)別特定的和先前定義的TEC亞型。從1周齡和16周齡小鼠胸腺中分離出CD45-Ter119-細(xì)胞，并用寡核苷酸偶聯(lián)抗體染色，每個(gè)抗體都分別針對(duì)EpCAM1、MHCII、UEA1、CD80、CD86、CD40、CD83、HVEM、CD73、SCA1、CD63、CD117、CD200、CD54、CD49a、CD274、CD9、Ly6G/Ly6C、CD6G/Ly6C和CD31。進(jìn)一步對(duì)標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序同時(shí)估計(jì)抗體衍生標(biāo)簽(ADTs)的豐度。
細(xì)胞聚類分析鑒定出了12個(gè)簇，其中數(shù)據(jù)分別來自單細(xì)胞基因表達(dá)譜分析或ADT。所進(jìn)行的細(xì)胞類型注釋是基于免疫基因組計(jì)劃（ImmGen）提供的基因表達(dá)譜，并驗(yàn)證了各個(gè)簇的內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞的身份。因此，所選擇的表面標(biāo)記物的組合足以識(shí)別各個(gè)間質(zhì)細(xì)胞類型。
對(duì)僅對(duì)TEC進(jìn)行基因表達(dá)譜分析的結(jié)果顯示出8個(gè)獨(dú)立的簇（A-H），而對(duì)ADT數(shù)據(jù)進(jìn)行分析則識(shí)別出9個(gè)簇（1-9）（圖5a，b）。將這兩種方法進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)幾乎成對(duì)的關(guān)系（圖5c）。觀察到的少數(shù)異常情況包括D和E簇，它們代表了4和5簇的混合，以及G簇，由于簇間Ly6C / Ly6G的差異表達(dá)而分裂成7和8簇（圖5d）。在CITE-seq分析中使用的有限數(shù)量的抗體鑒定出三個(gè)cTEC簇（定義為UEA1非反應(yīng)性細(xì)胞：1對(duì)應(yīng)于簇A [1/A]，2/B和3/C），三個(gè)mTEClo簇（MHCIIloCD80lo：4/D，5/E和9/H）和三個(gè)mTEChi亞群（MHCIIhiCD80hi：6/F，7/G和8）（圖5d-f）。
接下來，我們將CITE-seq定義的TEC簇身份分配給我們之前分類的亞型。簇1/A和在較小程度上的2/B對(duì)應(yīng)于圍產(chǎn)期cTEC。簇2/B進(jìn)一步與成熟cTEC相關(guān)，而簇3/C與成熟cTEC和亞型TEC相關(guān)（圖5d，f）。簇4/D和5/E與亞型TEC相關(guān)，而簇6/F與成熟mTEC和增殖TEC最為相似。簇7/G和8/G與成熟mTEC顯示出很高的相似性，而簇9/H與tuft-like mTEC相關(guān)。值得注意的是，無法檢測(cè)到后Aire mTEC和神經(jīng)（n）TEC的特征轉(zhuǎn)錄特征。此外，我們還分析了數(shù)據(jù)以確定最近描述的模擬mTEC亞群的基因轉(zhuǎn)錄特征。發(fā)現(xiàn)“tuft細(xì)胞”的轉(zhuǎn)錄本存在于簇9/H中，而類似microfold、enterocyte/hepatocyte和keratinocyte的TEC的mRNA特征則在成熟mTEC群體中的簇G/7-8中被檢測(cè)到。無法魯棒地鑒定出與神經(jīng)內(nèi)分泌、纖毛、離子細(xì)胞和肌肉細(xì)胞相關(guān)的基因在指定的TEC亞群中的表達(dá)。
特定TEC亞型隨年齡的變化，1周齡小鼠的1/A和2/B簇更加豐富，而16周齡小鼠的3/C、4/D、5/E、7/G和9/H簇的比例增加(圖5d)。在CITE-seq定義的簇中，第1/A簇中的Tec表達(dá)CD83、CD40和hvem蛋白最高，從而證實(shí)了該細(xì)胞為圍產(chǎn)期cTEC。這些標(biāo)志物在第2/B群中表達(dá)減少，在第3/C群中完全缺失，表明前者代表了圍產(chǎn)期和成熟/典型間樣cTEC之間的發(fā)育中間細(xì)胞狀態(tài)(圖5d，g)。此外，cTEC成熟的同時(shí)，F(xiàn)oxn1轉(zhuǎn)錄減少，CD73、CD49a和Sca1蛋白表達(dá)增加。
CD117、CD63和Sca1蛋白的差異表達(dá)(通過ADT測(cè)量)將9/H簇確定為簇樣mTEC(CD117+CD63-Sca1-；見上文和圖5d，h)，從而證實(shí)了用于識(shí)別這些細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)定義和門控策略是準(zhǔn)確和實(shí)用的(圖4g-i)。在第9/H簇(圖5h)中檢測(cè)到Dclk1和Ceacam1轉(zhuǎn)錄本，并與管狀mTEC亞型(圖5g，f)具有很高的相似性，進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。
基于ADT的Sca1蛋白表達(dá)檢測(cè)與cTEC(第3/C簇)和mTEClo亞群(第4+5/D+E簇；圖5d，f，h)中具有典型TEC轉(zhuǎn)錄特征的細(xì)胞相匹配。因此，僅通過Sca1的表達(dá)就可以明確地識(shí)別出典型的TEC。由于識(shí)別典型TEC的轉(zhuǎn)錄簽名分布在三個(gè)CITE-seq定義的簇(3/C、4/D和5/E；圖5d，f)上，CD146表達(dá)的檢測(cè)似乎進(jìn)一步解卷TEC的異質(zhì)性，因?yàn)镾ca1+cTEC和Sca1+mTEClo的一部分CD146+染色呈陽性(圖3e)。
基于ADT的表面標(biāo)記文件確定了單個(gè)TEC亞型。然而，相應(yīng)的基因表達(dá)譜本身不足以識(shí)別這些細(xì)胞，尤其是因?yàn)楸砻娴鞍缀蚏NA表達(dá)之間偶爾存在差異。因此，CITE-seq可以驗(yàn)證所選的、新穎的表面標(biāo)記和所選的門控策略的實(shí)用性。他們共同鑒定了對(duì)應(yīng)于特定轉(zhuǎn)錄定義的簇的四個(gè)TEC亞群和代表兩個(gè)相關(guān)簇的混合的兩個(gè)亞群，即UEA1-CD83+CD40+Sca1-圍產(chǎn)期cTEC(簇1/A)，UEA1-CD83-CD40-Sca1-成熟cTEC(2/B)，UEA1-CD83-CD40-Sca1+互典型mTEC(3/C)，UEA1+MHCIIloCD80loSca1+典型mTEC(4+5/D+E)，UEA1+MHCIIhiCD80hi成熟mTEC(6+7+8/F+G)，以及UEA1+MIIloCD80loSca1-CD63-CD66a+117+CDt-like mTEC(9/H)。
圖5 CITE-seq驗(yàn)證新的TEC標(biāo)記
5、圍產(chǎn)期cTEC表現(xiàn)出更強(qiáng)的陽性選擇潛力
接下來，我們?cè)噲D將圍產(chǎn)期cTEC定位于胸腺基質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)。由于圍產(chǎn)期cTEC的Ly51豐度高于其他皮質(zhì)上皮細(xì)胞群(圖2g)，我們使用這種差異在胸腺組織切片上定位圍產(chǎn)期cTEC(圖6a)。免疫組織學(xué)中Ly51信號(hào)強(qiáng)度的定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞靠近髓質(zhì)，Ly51信號(hào)逐漸增加，但細(xì)胞角蛋白8(K8)從被膜下區(qū)域向內(nèi)皮質(zhì)并最終深入皮質(zhì)呈不變的染色(圖6a，b)。
新分配的表面標(biāo)記使單個(gè)cTEC群體的體外分離和功能測(cè)試成為可能。因此，我們研究了圍產(chǎn)期(CD83+CD40+Sca1?)和非圍產(chǎn)期(CD83?CD40?)cTEC對(duì)陽性胸腺細(xì)胞選擇的影響。我們將這些細(xì)胞在胸腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)物(TECx)中與CD69-CD4+CD8+(即預(yù)選雙陽性)胸腺細(xì)胞共同培養(yǎng)兩天。然后分析胸腺細(xì)胞與陽性胸腺選擇相關(guān)的表型特征，即TCR和CD5的上調(diào)(圖6c)。與由其他皮質(zhì)上皮細(xì)胞組成的聚集體相比，由圍產(chǎn)期cTEC組成的TECx的胸腺細(xì)胞總數(shù)和CD5hiTCRβhi的胸腺細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖6d)。綜上所述，這些結(jié)果確定了圍產(chǎn)期cTEC與髓質(zhì)并列，在選擇陽性胸腺細(xì)胞方面特別有效。
圍產(chǎn)期cTEC數(shù)量隨年齡增長(zhǎng)明顯減少。因此，我們探索了這種變化是否與實(shí)施陽性胸腺細(xì)胞選擇效率的變化平行。因此，我們監(jiān)測(cè)和比較了4周齡和16周齡胸腺細(xì)胞的成熟情況，并根據(jù)TcRβ和CD69的表達(dá)對(duì)胸腺細(xì)胞的成熟程度進(jìn)行了分類(即0期：TcRβ?CD69?→階段1：TcRβ+CD69+/?→階段2：TcRβ+CD69+→階段3：TcRβ+CD69?)。在老年動(dòng)物中，預(yù)選胸腺細(xì)胞(即階段0)的比例增加，而具有選擇后表型(階段2和3)的細(xì)胞的相對(duì)豐度顯著降低(圖6e，f)。這些體內(nèi)結(jié)果表明，老年小鼠積極選擇胸腺細(xì)胞的能力受到了損害，這與圍產(chǎn)期cTEC的可用性下降有關(guān)(圖2e，f)。
圖6 圍產(chǎn)期cTEC顯示陽性選擇能力增強(qiáng)
6、胸腺細(xì)胞串?dāng)_誘導(dǎo)圍產(chǎn)期cTEC成熟
最后，我們研究了胸腺交叉素是否能解釋圍產(chǎn)期cTEC比例隨年齡降低和胸腺細(xì)胞出生后增長(zhǎng)之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系。因此，我們首先確定了RAG2缺陷(RAG2?/?)小鼠的圍產(chǎn)期cTEC的比例，這些小鼠的胸腺發(fā)育不良繼發(fā)于胸腺細(xì)胞在DN3a階段的發(fā)育停滯。我們發(fā)現(xiàn)在這些小鼠中，圍產(chǎn)期cTEC的比例很高，不受年齡的影響(圖7a)。因此，胸腺細(xì)胞處于發(fā)育階段直到β-臨界點(diǎn)，并不影響圍產(chǎn)期cTEC比例隨年齡的變化。
為了探究后期發(fā)育階段的胸腺細(xì)胞，特別是未經(jīng)選擇的CD4+CD8+（雙陽性，DP）胸腺細(xì)胞是否控制圍產(chǎn)期TEC的比例，我們將抗CD3ε的抗體注射到Rag2-/-小鼠體內(nèi)。這種處理會(huì)導(dǎo)致未選擇的DP胸腺細(xì)胞的顯著增加。在注射抗體或?qū)φ瘴锖蟮乃闹?，?jīng)過活動(dòng)治療的Rag2-/-小鼠的胸腺中含有大量的DP胸腺細(xì)胞，這與cTEC區(qū)域的數(shù)量和表型變化相關(guān)（圖7b-e）。后者通過圍產(chǎn)期cTEC的減少和非圍產(chǎn)期cTEC的增加，特別是Sca1+細(xì)胞的增加而標(biāo)記出來（圖7d，e），這與我們的CITE-seq數(shù)據(jù)中的亞型TEC（圖5d，f，h）相一致。綜合這些結(jié)果表明，圍產(chǎn)期cTEC的比例受到未選擇的DP胸腺細(xì)胞的豐度和/或信號(hào)傳導(dǎo)的控制機(jī)制影響。
圖7 與胸腺細(xì)胞的串?dāng)_促進(jìn)cTEC成熟。
實(shí)驗(yàn)方法
TEC、流式細(xì)胞術(shù)、大規(guī)模平行流式細(xì)胞術(shù)、Infinity Flow、單細(xì)胞聚類與表達(dá)分析、組織學(xué)分析、TECx、CITE-seq、批量RNA測(cè)序。
參考文獻(xiàn)
Klein, F., Veiga-Villauriz, C., B?rsch, A. et al. Combined multidimensional single-cell protein and RNA profiling dissects the cellular and functional heterogeneity of thymic epithelial cells. Nat Commun 14, 4071 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39722-9