細胞外囊泡中的miR-126-5p和miR-212-3p在輻射誘導(dǎo)的血管炎癥早期激活單核細胞參與動脈粥樣硬化

實驗方法：細胞培養(yǎng)，Western blotting，巨噬細胞浸潤測量，RNA提取，qRT-PCR，Small RNA-sequencing，生信分析，GO和KEGG分析，雙熒光素酶分析
   
      在癌癥治療和核事故中暴露于輻射的人在長期存活者中心血管結(jié)果的風(fēng)險增加。細胞外囊泡（EVs）參與輻射誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙，但其在輻射后血管炎癥早期階段的作用尚不完全清楚。在這里，作者證明了含有miRNAs的內(nèi)皮細胞來源的EVs在輻射誘導(dǎo)的血管炎癥中啟動單核細胞活化。體外共培養(yǎng)和體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)表明，內(nèi)皮EVs可以敏感地通過輻射暴露以劑量依賴的方式增加，并刺激單細胞釋放單核EVs和粘附到內(nèi)皮細胞，同時增加編碼細胞-細胞相互作用的特異性配體的基因的表達。小RNA測序和使用模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染解釋了富集在內(nèi)皮EVs中的miR-126-5p和miR-212-3p在輻射暴露后通過單核細胞激活啟動血管炎癥。此外，在輻射誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型小鼠循環(huán)內(nèi)皮EVs中可以檢測到miR-126-5p，并且發(fā)現(xiàn)其與血漿致動脈粥樣硬化指數(shù)密切相關(guān)。綜上所述，作者的研究表明，在輻射誘導(dǎo)的血管損傷中，內(nèi)皮EVs中存在的miR-126-5p和miR-212-3p介導(dǎo)炎癥信號激活單核細胞。更好地了解循環(huán)內(nèi)皮EVs含量可以促進其作為輻射暴露后動脈粥樣硬化的診斷和預(yù)后生物標志物。研究于2023年3月發(fā)表于期刊《J Extracell Vesicles》上，IF：17.337。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：
1、循環(huán)血漿EVs的數(shù)量隨著暴露劑量的增加而增加
      為研究輻射暴露對血漿EVs的影響，作者測定0、0.1和1 Gy全身照射實驗小鼠血漿中EVs的生成量。首先，根據(jù)2018年國際細胞外囊泡學(xué)會提出的《細胞外囊泡研究的最小信息》指南對分離的EV進行鑒定。通過納米顆粒跟蹤分析（NTA）和透射電鏡（TEM）測得的大多數(shù)EVs的粒徑小于200 nm，并通過western blot分析驗證這些EVs的質(zhì)量和純度（圖1a-c）。流式細胞術(shù)檢測到受照小鼠血漿EVs數(shù)量增加（圖1d），ImageStreamX分析直觀地證實了血漿EVs的熒光事件（圖1e）。兩種分析方法均用于增加結(jié)果的穩(wěn)健性。接下來，作者擴大照射劑量范圍，考察0、0.1、0.5、1和5 Gy不同劑量輻射的EVs響應(yīng)（圖1f）。循環(huán)內(nèi)皮EVs水平在暴露后敏感地增加，并呈劑量依賴性，即使在低劑量（0.1 Gy）下也是如此。有趣的是，內(nèi)皮細胞來源的EVs，如特異性標志物CD105⁺、CD31⁺/CD42^-和146⁺的存在，以劑量依賴的方式顯著升高。其他細胞來源的EVs，標記為CD11b ⁺（單核細胞），CD41 ⁺（血小板）和CD45 ⁺（白細胞），也顯著增加。損傷的血管結(jié)構(gòu)進一步通過照射小鼠腸道組織中單核細胞系細胞浸潤增加得到驗證（圖2c），這對應(yīng)于中性粒細胞和巨噬細胞向小腸固有層的遷移（圖2d）。
      為探究輻射暴露對人體血漿EVs的影響，對6名健康獻血者的血液樣本也進行了不同劑量的輻射（0.1 ~ 5 Gy）。在淋巴細胞中，雙著絲粒染色體和γ H2AX焦點的數(shù)量，即已知的輻射誘導(dǎo)損傷的基因組標記，在照射后以劑量依賴的方式增加。通過統(tǒng)計輻射特異的雙著絲粒染色體數(shù)目，計算得到的輻射實際劑量與估算劑量具有很好的相關(guān)性（圖2a）。輻射暴露增加γ H2AX指示的DNA損傷灶數(shù)目。在輻射劑量大于0.5 Gy的淋巴細胞中觀察到兩個以上的灶（圖2b）。在線性回歸模型中，以CD31⁺/CD42^-，CD105 ⁺，CD146 ⁺和CD144 ⁺標記的人血漿EVs和內(nèi)皮EVs水平隨著輻射劑量的增加而增加，在受輻射的小鼠血液樣本中觀察到（圖2c）。除白細胞來源的EVs（CD45 ⁺）外，單核細胞（CD14 ⁺ , HLA-DR ⁺）和血小板來源的EVs（CD41 ⁺）也顯著增加。與在小鼠中觀察到的結(jié)果類似，輻射劑量與人類EVs產(chǎn)量呈正相關(guān)（表1）。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明，輻射引起基因組和細胞損傷后，EVs從人和小鼠的血細胞中敏感地分泌。

圖1 循環(huán)血漿EVs的數(shù)量隨著暴露劑量的增加而增加

圖2 在人體血液樣本中，細胞外囊泡( EVs )是由不同類型的細胞響應(yīng)輻射照射而釋放的

2、在共培養(yǎng)體系中，內(nèi)皮細胞和單核細胞在輻射暴露后的不同時間點產(chǎn)生EVs

      作者利用含有內(nèi)皮細胞（Huvecs）和單核細胞（Thp-1Cells）的共培養(yǎng)體系來探討輻射誘導(dǎo)的細胞通訊在血管結(jié)構(gòu)中的作用。作者首先檢測了輻射暴露后共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的EV水平。內(nèi)皮EVs（CD105和CD31陽性）在輻射暴露（暴露后4 h）后的早期時間點顯著增加，并在24和48 h消失（圖3a）。單核EVs（CD11b、HLA-DR陽性）的增加在暴露后24 h才被檢測到（圖3b）。這些數(shù)據(jù)表明，內(nèi)皮細胞和單核細胞可以通過增加EVs的產(chǎn)生來應(yīng)對輻射暴露，細胞特異性EVs在照射后的不同時間點達到峰值。單核細胞粘附是炎癥反應(yīng)的初始步驟，在輻射暴露后24 h，單核細胞粘附被激活（圖3c），單核細胞粘附分子LFA1和Mac1表達升高（圖3d）。相應(yīng)地，在輻射后24和48 h，內(nèi)皮細胞黏附分子ICAM-1和ICAM-2的表達也增加（圖3e）。兩種細胞均表現(xiàn)出伴隨EVs產(chǎn)生的多種細胞因子表達增加。具體來說，HUVECs中TNF-α、干擾素（INF）-γ和白細胞介素（IL）-在4 h高表達，但在24 h消失，這與內(nèi)皮EVs的產(chǎn)生平行（圖3f）。在THP-1細胞中，這些細胞因子在輻射暴露后24 h表達增加，即觀察到粘附活性增強的時間點（圖3g）。這些數(shù)據(jù)表明，在作者的血管共培養(yǎng)體系中，輻射首先誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞產(chǎn)生促炎信號，導(dǎo)致單核EVs的產(chǎn)生和單核細胞的激活，隨后發(fā)生一系列復(fù)雜的細胞因子反應(yīng)。

圖3 內(nèi)皮細胞和單核細胞EVs在輻射暴露后的不同時間點釋放

3、輻射誘導(dǎo)的內(nèi)皮EVs可促進單核細胞活化，且不依賴于輻射暴露

      為檢測輻射后產(chǎn)生的內(nèi)皮EVs是否可以直接誘導(dǎo)單核細胞活化，在輻射后4 h，用HUVEC-THP-1共培養(yǎng)上清中分離的EVs處理未經(jīng)輻射的THP-1細胞。輻射暴露顯著增加內(nèi)皮細胞EVs的數(shù)量，但并沒有增加培養(yǎng)液中單核細胞EVs的數(shù)量（圖4a）。EVs攝取實驗顯示HUVECs來源的EVs很容易被未照射的THP-1細胞攝?。▓D4b）。與內(nèi)皮細胞EVs共孵育24 h后，觀察受體單核細胞中EVs的產(chǎn)生（圖4c）。相反，當(dāng)THP-1細胞與EVs耗竭的條件培養(yǎng)基孵育時，單核細胞來源的EVs沒有增加。令人驚訝的是，作者觀察到THP-1細胞經(jīng)輻射誘導(dǎo)的內(nèi)皮EVs處理后，其表面粘附分子表達增加，與直接輻射暴露后觀察到的水平相當(dāng)（圖4d）。值得注意的是，隨著內(nèi)皮EVs濃度的增加，THP-1細胞表面黏附分子的表達顯著增加（圖4e）。這一發(fā)現(xiàn)與輻射誘導(dǎo)的內(nèi)皮EVs處理的單核細胞表面標志基因表達升高相互印證（圖4f）?？傊@些數(shù)據(jù)表明輻射誘導(dǎo)的內(nèi)皮EVs可以直接刺激單核細胞的粘附活性，即使在沒有輻射暴露的情況下。

圖4 來自輻照共培養(yǎng)的內(nèi)皮EVs在體外誘導(dǎo)非輻照單核細胞的活化

4、輻射誘導(dǎo)的內(nèi)皮EVs可以在非輻射小鼠中啟動免疫反應(yīng)
      為研究輻射誘導(dǎo)的內(nèi)皮EVs在小鼠體內(nèi)的潛在作用，將輻射后24 h的小鼠血漿EVs通過尾靜脈注射到非輻射小鼠體內(nèi)（圖5a）。與單核細胞EVs相比，內(nèi)皮細胞EVs在輻射暴露后顯著增加（圖5b-c）。接受輻射誘導(dǎo)的EVs的小鼠在外周血和脾臟中顯示髓系細胞的增加，但在骨髓中沒有，包括中性粒細胞（CD45 ⁺ / CD11b ⁺ / Ly6G ⁺）和巨噬細胞（CD45 ⁺ / CD11b ⁺ / F4 / 80 ⁺），已知的急性炎癥免疫細胞（圖5d）。值得注意的是，在血液和脾臟中也檢測到白細胞粘附分子如LFA1和Mac1的表達增加，但在骨髓中沒有檢測到（圖5e）。利用細胞因子芯片，作者發(fā)現(xiàn)一些內(nèi)皮功能障礙相關(guān)標志物，包括胱抑素C（CST3），CD105，幾丁質(zhì)酶3樣蛋白1（CHI3L1）和絲氨酸蛋白酶抑制劑F1（SERPINF1），在輻射誘導(dǎo)的EVs處理的動物淋巴細胞中高表達（圖5f）。此外，中性粒細胞標志物（C1qR1和MPO）和中性粒細胞募集趨化因子（MMP9和CXCL5）的表達在輻射誘導(dǎo)的EVs處理后增加?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明，從受照小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移EVs可以通過急性炎癥細胞的擴增，系統(tǒng)性地啟動受體小鼠的免疫激活。

圖5 輻照小鼠血漿EVs誘導(dǎo)非輻照小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答

5、內(nèi)皮EVs中的miR^-126和miR^-212傳遞給對輻射暴露有反應(yīng)的單核細胞
      以往的研究表明，EVs中的miRNA能夠在細胞間傳遞炎癥信號。miRNA能夠靶向多個與多種疾病相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控基因。為分析miRNAs，在1Gy照射后從小鼠血漿中分離出內(nèi)皮EVs，并進行小RNA測序。利用85個在輻射和對照樣品中差異表達的miRNAs（倍數(shù)變化閾值為1.5）構(gòu)建Aheatmap（圖6a）。使用DIANA-mirPath軟件對這些差異表達的miRNA進行通路分析，并使用R編程語言中的DESeq2包測量統(tǒng)計學(xué)意義。在顯著變化的29個miRNA（p < 0.05）中，通過對輻射響應(yīng)相關(guān)miRNA的文獻調(diào)研，篩選出10個候選miRNA（圖6b和表2）。qRT-PCR驗證候選miRNAs在輻射后4 h共培養(yǎng)的HUVECs和內(nèi)皮EVs，以及轉(zhuǎn)移后24 h內(nèi)皮EVs處理的THP-1細胞中的表達模式。在10個miRNAs中，有6個miRNAs在輻射后內(nèi)皮EVs中的表達模式發(fā)生了顯著變化（圖6c）。其中，miR-126-5p和miR-212-3p在輻射后的HUVECs和內(nèi)皮EVs以及內(nèi)皮EVs處理的THP-1細胞中表達顯著增加（圖6d-e）。電離輻射后，少數(shù)miRNAs如miR-10a-5p、miR-29b-3p、miR-142-5p和miR-146b-5p在內(nèi)皮EVs中表達降低，但在HUVECs和THP-1細胞中的表達模式不一致。這些結(jié)果表明，當(dāng)血管細胞受到輻射時，miR-126-5p和miR-212-3p可以通過EVs從內(nèi)皮細胞傳遞到單核細胞。

圖6 EVs在血液中響應(yīng)輻射暴露而釋放

6、miR-126和miR-212促進單核細胞粘附以應(yīng)對輻射暴露
      為證明內(nèi)皮EVs可以將輻射誘導(dǎo)的損傷信號從內(nèi)皮細胞傳遞到炎癥細胞，作者使用模擬物和抑制劑來研究miR-126-5p和miR-212-3p的功能。抑制劑處理降低了與THP-1細胞共培養(yǎng)24 h后HUVECs中靶miRNA的表達（圖7a）。此外，HUVECs轉(zhuǎn)染miR-126-5p和miR-212-3p抑制劑后，共培養(yǎng)的THP-1細胞在輻射后24 h黏附分子的表達降低（圖7b），這與作者之前在THP-1細胞上的實驗結(jié)果相反，如圖4d所示。未經(jīng)輻射照射的共培養(yǎng)THP-1細胞中細胞黏附分子的表達無變化。此外，使用miR-126-5p或miR-212-3p mimic轉(zhuǎn)染可增強未照射的THP-1細胞表面黏附分子的表達（圖7d）。miR-126-5p和miR-212-3p模擬物轉(zhuǎn)染THP-1細胞后，即使沒有輻射照射，細胞表面粘附分子的表達也增加，與輻射后的THP-1細胞相似。作者使用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了這兩個miRNA的直接和特異性調(diào)控。熒光素酶報告載體含有與miR-126-5p或miR-212-3p靶基因的結(jié)合序列相匹配的序列，可能為antago-miRNA。mi RNAs模擬物轉(zhuǎn)染THP-1細胞后，與其配對的靶位點熒光素酶活性明顯降低（圖7e）。此外，通過與每個miRNA特異的antago-miRNA構(gòu)建的熒光素酶報告載體，轉(zhuǎn)染miR-126-5p或miR-212-3p的模擬物后，粘附分子的表達顯著降低（圖7f）?？傊@些數(shù)據(jù)表明miR-126-5p和miR-212-3p均介導(dǎo)了輻射后單核細胞通過騎乘內(nèi)皮細胞的EVs而發(fā)揮粘附活性所需的刺激信號。

圖7 miR-126-5p和miR-212-3p介導(dǎo)內(nèi)皮細胞到單核細胞的輻射誘導(dǎo)損傷信號

7、miR-126和miR-212促進THP-1源性巨噬細胞泡沫化
      接下來作者研究了miR-126-5p和miR-212-3p對泡沫細胞形成的影響。在與內(nèi)皮細胞粘附后，循環(huán)單核細胞進入內(nèi)膜區(qū)域并分化為巨噬細胞。這些巨噬細胞可以攝取ox-LDL顆粒并在炎癥過程中轉(zhuǎn)化為泡沫細胞。用miRNA mimics處理THP-1細胞后，PMA誘導(dǎo)的巨噬細胞分化顯著增加（圖8a）。此外，ox-LDL處理THP-1源性巨噬細胞導(dǎo)致細胞內(nèi)脂滴增多，細胞呈現(xiàn)泡沫細胞形態(tài)。用miRNA模擬物處理THP-1細胞后，泡沫細胞中的脂質(zhì)積累也增加（圖8b-c）。此外，miRNA mimics處理細胞后，細胞內(nèi)總膽固醇和膽固醇酯的水平也增加（圖8d-e）。與miR-126-5p mimic相比，miR-212-3p mimic處理后巨噬細胞分化和泡沫細胞形成略有增強，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這些結(jié)果表明，miR-126-5p和miR-212-3p可以促進單核細胞分化和泡沫細胞形成，而這被認為是與動脈粥樣硬化等慢性炎癥性疾病相關(guān)的主要病理特征。

圖8 MiR-126-5p和miR-212-3p促進巨噬細胞分化和ox-LDL攝取

8、輻射誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化Ldlr^-/-小鼠血漿EVs及其貨物miR^-126-5p水平升高
      在證實內(nèi)皮細胞來源的EVs可促進輻射后單核細胞黏附導(dǎo)致炎癥的基礎(chǔ)上，作者接下來評估在具有代表性的輻射誘導(dǎo)炎癥性疾病模型-^-輻射誘導(dǎo)動脈粥樣硬化小鼠中是否可以檢測到類似的EVs。通過評估輻射暴露Ldlr^-/-小鼠主動脈根部脂質(zhì)斑塊的形成，驗證了輻射誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化的成功發(fā)展（圖9a）。通過測量輻照小鼠的血脂水平，包括總膽固醇、總甘油三酯和高密度膽固醇來評估冠心病的致動脈粥樣硬化風(fēng)險指數(shù)（圖9b）。輻射后Ldlr^-/-小鼠血漿EVs數(shù)量與輻射后動脈粥樣硬化發(fā)生風(fēng)險成正比（圖9c）。值得注意的是，作者發(fā)現(xiàn)在輻射誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型小鼠血漿EVs中，miR-126-5p的水平顯著升高，而miR-212-3p的水平?jīng)]有顯著變化。此外，Pearson ' s相關(guān)分析顯示斑塊形成、EVs分泌和EVs中miR-126-5p表達與放射性動脈粥樣硬化臨床風(fēng)險指標相關(guān)（圖9f-h）。總之，這些數(shù)據(jù)表明EVs中存在的miR-126-5p可以介導(dǎo)動脈粥樣硬化發(fā)展過程中輻射誘導(dǎo)的炎癥信號。此外，血漿EVs及其貨物miR-126-5p可用于評估輻射后較長時間內(nèi)動脈粥樣硬化發(fā)生的風(fēng)險。

圖9 輻射誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化Ldl ^-/-小鼠血漿內(nèi)皮細胞及其載貨量增加

圖10 機制圖

參考文獻
Choi, Y. Y., Kim, A., Lee, Y., Lee, Y. H., Park, M., Shin, E., Park, S., Youn, B., & Seong, K. M.（2023）. The miR-126-5p and miR-212-3p in the extracellular vesicles activate monocytes in the early stage of radiation-induced vascular inflammation implicated in atherosclerosis. Journal of Extracellular Vesicles, 12, e12325. https://doi.org/10.1002/jev2.12325