國(guó)自然熱點(diǎn)之焦亡

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2021-10-12
細(xì)胞焦亡又稱(chēng)細(xì)胞炎性壞死,是一種最新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞程序性死亡方式。近年來(lái)在國(guó)自然基金中標(biāo)項(xiàng)目中,細(xì)胞焦亡相關(guān)項(xiàng)目日益......

細(xì)胞焦亡又稱(chēng)細(xì)胞炎性壞死,是一種最新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞程序性死亡方式。主要通過(guò)炎癥小體介導(dǎo)包含Caspase-1在內(nèi)的多種Caspase的激活,造成包括GSDMD在內(nèi)的多種Gasdermin家族成員發(fā)生剪切和多聚化,造成細(xì)胞穿孔,進(jìn)而引起細(xì)胞死亡。相比于細(xì)胞凋亡,細(xì)胞焦亡發(fā)生的更快,并會(huì)伴隨著大量促炎癥因子的釋放,在形態(tài)學(xué)上同時(shí)具有壞死和凋亡的特征。近年來(lái)在國(guó)自然基金中標(biāo)項(xiàng)目中細(xì)胞焦亡相關(guān)項(xiàng)目日益增多,且增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯。

乳腺癌 (BrCa) 是最常見(jiàn)的癌癥,也是女性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。隨著乳腺篩查的發(fā)展,5年相對(duì)生存率有所提高,但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性BrCa的治療仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。今天我們講一篇關(guān)于乳腺癌焦亡的文章,該文章題名為Tumor suppressor DRD2 facilitates M1 macrophages and restricts NF-κB signaling to trigger pyroptosis in breast cancer,202135日發(fā)表于Theranostics期刊。


DRD2通過(guò) BrCa 中的啟動(dòng)子甲基化被轉(zhuǎn)錄下調(diào)

為了研究新的潛在腫瘤抑制基因 (TSG),使用BrCa組織和正常組織進(jìn)行 測(cè)序篩選。發(fā)現(xiàn)與正常乳腺組織相比,BrCa組織中DRD2mRNA表達(dá)顯著下調(diào)。通過(guò)IHC染色,與BrCa組織相比,在正常乳腺組織中也發(fā)現(xiàn)了更高的DRD2蛋白水平。TCGA數(shù)據(jù)顯示,在BrCaDRD2 mRNA的下調(diào),并且DRD2的啟動(dòng)子甲基化在BrCa中也更頻繁。在另一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)MethHC上進(jìn)一步分析了表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。與DRD3DRD4不同,發(fā)現(xiàn)DRD2伴隨啟動(dòng)子的高甲基化狀態(tài)被下調(diào)?;?/span>TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析BrCa患者DRD2表達(dá)與病理特征的關(guān)系。DRD2的高表達(dá)與患者年齡呈負(fù)相關(guān)。此外,在HER2 陰性患者中DRD2表達(dá)較高。還分析了DRD2啟動(dòng)子甲基化與病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果表明,DRD2甲基化增加在老年人群中更為常見(jiàn)?;?/span>KmplotDRD2 的更高表達(dá)促進(jìn)了BrCa患者的更長(zhǎng)生存期,這在HER2陽(yáng)性基因型患者中也可見(jiàn)。但是這種優(yōu)勢(shì)在患者中沒(méi)有看到。根據(jù)RT-PCRMSP結(jié)果,與永生化的正常乳腺細(xì)胞系相比,幾乎所有BrCa細(xì)胞系中都可以看到DRD2 mRNA表達(dá)的下調(diào)以及的啟動(dòng)子甲基化。因此,DRD的高甲基化頻率可能有助于其下調(diào)BrCa。用 Aza進(jìn)行藥理去甲基化恢復(fù)了兩個(gè)BrCa細(xì)胞系MDA-MB231BT549DRD2的表達(dá)。DRD2 是一種潛在的 TSG,也是預(yù)測(cè) BrCa 患者預(yù)后的有希望的生物標(biāo)志物。


DRD2 作為 TSG 起作用并抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)

構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)DRD2MDA-MB231BT549細(xì)胞并通過(guò)RT-PCRWB驗(yàn)證。DRD2的過(guò)表達(dá)抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),如CCK8 測(cè)定所證明的。并且DRD2也損害了生存能力,如克隆形成試驗(yàn)所示和軟瓊脂形成試驗(yàn)。DRD2表達(dá)顯著促進(jìn)BrCa細(xì)胞凋亡并在G2/M階段阻斷MDA-MB231BT549。此外,DRD2的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了BrCa細(xì)胞對(duì)PTX的敏感性。在劃痕試驗(yàn)中,DRD2 的異位表達(dá)表現(xiàn)出比對(duì)照組更小遷移能力。DRD2的過(guò)表達(dá)顯著降低了BrCa遷移和侵襲。在體內(nèi)進(jìn)一步確定了DRD2的腫瘤抑制作用。皮下腫瘤模型表明源自 DRD2 過(guò)表達(dá)模型的腫瘤體積和重量均減少。



EMT在癌細(xì)胞的遷移和侵襲中很重要。在DRD2過(guò)表達(dá)后,MDA-MB231 BT549 的形態(tài)變?yōu)樯掀宇?lèi)型。WB結(jié)果表明 E-鈣粘蛋白的表達(dá)增加,波形蛋白以及另一種前 EMT 轉(zhuǎn)錄因子 ZEB1 的表達(dá)降低。IF染色還表明DRD2的異位表達(dá)誘導(dǎo)MDA-MB231失去間充質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白并獲得上皮標(biāo)志物E-鈣粘蛋白。總之,DRD2 能夠在體外和體內(nèi)抑制腫瘤發(fā)生,并且 DRD2 還抑制 BrCa 細(xì)胞的 EMT。

DRD2 轉(zhuǎn)染的 BrCa 促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1 表型

據(jù)報(bào)道,DRD2以前調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M的極化。在這項(xiàng)研究中,來(lái)自BrCa患者的IHC結(jié)果表明,在具有較高 DRD2 表達(dá)的 BrCa 組織中,M1巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)增加,M2巨噬細(xì)胞的濾過(guò)減少。為了進(jìn)一步研究DRD2在調(diào)節(jié)TAM中的功能,構(gòu)建了BrCa和巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)。當(dāng)巨噬細(xì)胞與表達(dá) DRD2BrCa 細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),如qRT-PCR所示,M1 表型的標(biāo)志物增加,而M2巨噬細(xì)胞 標(biāo)志物下調(diào)。qRT-PCR 還證實(shí)載體轉(zhuǎn)染的BrCa細(xì)胞將巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)為M2型。WB結(jié)果確定M1標(biāo)志物iNOS被過(guò)表達(dá)DRD2BrCa細(xì)胞上調(diào),而M2標(biāo)志物CD206 被下調(diào)。IF染色顯示巨噬細(xì)胞在與表達(dá)DRD2的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后表現(xiàn)出M1表型。上述結(jié)果表明BrCa中的DRD2具有將巨噬細(xì)胞重編程為M1表型的能力。

為了探索將巨噬細(xì)胞極化為M1表型的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,進(jìn)行了細(xì)胞因子陣列分析。結(jié)果表明,誘導(dǎo)M1極化的兩種經(jīng)典細(xì)胞因子TNFαIFN γ沒(méi)有增加。然而,與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后,DRD2 顯著下調(diào)IL-6IL-10。進(jìn)一步證實(shí)IL-6IL-10的下調(diào)。因此,DRD2可以將巨噬細(xì)胞重新編程 M1表型,并在串?dāng)_期間顯著下調(diào)IL-6IL-10


DRD2 重編程的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的焦亡

來(lái)自小鼠模型的攜帶 DRD2 的腫瘤表現(xiàn)出增加的腫瘤細(xì)胞死亡,如 HE 所示。在IHC染色中,表達(dá) DRD2 的腫瘤樣本顯示更高的 pMLKL 表達(dá)。根據(jù) TUNEL 測(cè)定,DRD2 還促進(jìn)了體內(nèi)細(xì)胞凋亡。GSDM而不是GSDMDDRD2 上調(diào)。巨噬細(xì)胞在串?dāng)_過(guò)程中進(jìn)一步促進(jìn)了DRD2轉(zhuǎn)染的BrCa細(xì)胞GSDME的表達(dá)。在表達(dá)DRD2BrCa細(xì)胞中,IL-1β 也被巨噬細(xì)胞上調(diào)。WB 結(jié)果所表明,DRD2誘導(dǎo)MLKL的磷酸化,在共培養(yǎng)過(guò)程中被巨噬細(xì)胞抑制。此外,DRD2 表達(dá)激活了caspase-8。假設(shè),DRD2 可能在與巨噬細(xì)胞的串?dāng)_期間誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。當(dāng)在BrCa細(xì)胞中與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),NLRP3的組裝在表達(dá)DRD2BrCa 細(xì)胞中被觸發(fā)。IL-1βIL-18的成熟也被激活的caspase-1蛋白水解誘導(dǎo)。Cleaved caspase-3在共培養(yǎng)過(guò)程中被上調(diào)。切割的caspase-3可以切割GSDMEN端。此外,在共培養(yǎng)過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)GSDMEN端在BrCa細(xì)胞中被切割并表達(dá)DRD2。為了確定細(xì)胞焦亡是否由M巨噬細(xì)胞觸發(fā),使用LPS誘導(dǎo)的M1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基,結(jié)果表明巨噬細(xì)胞僅觸發(fā)NLRP3組裝并切割具有DRD2表達(dá)的BrCa細(xì)胞中的GSDME。上述結(jié)果表明 DRD2 可以誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡 (PCD),包括細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡,并且這些事件被巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)換為細(xì)胞焦亡。并且M1巨噬細(xì)胞以 DRD2依賴(lài)性方式觸發(fā) BrCa 細(xì)胞的焦亡。


DRD2 通過(guò)中斷 TAK1 的磷酸化來(lái)限制 NF-κB 信號(hào)激活

NF-κB信號(hào)的激活對(duì)于觸發(fā)炎性體組裝和隨后的細(xì)胞焦亡至關(guān)重要。探索DRD2對(duì)NF-κB活化的影響。IF染色表明DRD2幾乎阻斷p-p65的核轉(zhuǎn)位,但是這種抑制被巨噬細(xì)胞抵消了。細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的提取物也表明DRD2抑制p-p65的核易位。如WB結(jié)果所示,DRD2通過(guò)LPS刺激抑制了IKKα/β、IκBαp65的磷酸化。異位DRD2表達(dá)也顯著抑制了巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的p65磷酸化和 IKKα/β的上游激活。WB結(jié)果顯示 DRD2下調(diào) ICAM-1,NF-κB 的下游靶標(biāo)。然而,這種下調(diào)被巨噬細(xì)胞抵消。IKKα/β磷酸化的抑制表明DRD2負(fù)介導(dǎo)IKK 復(fù)合物的上游。TAK1在催化IKKαIKKβ中起著關(guān)鍵作用。TAK1的磷酸化被異位DRD2表達(dá)顯著抑制。一般而言,DRD2 通過(guò)中斷其上游激酶 TAK1 來(lái)抑制NF-κB信號(hào)激活。

作為典型的G蛋白偶聯(lián)受體,DRD2的內(nèi)在化誘導(dǎo)質(zhì)膜招募其適配器β-arrestin2的的并且增加了其親和力結(jié)合β-arrestin2的。LPSCM刺激了DRD2β-arrestin2的蛋白-蛋白結(jié)合。IF染色DRD2似乎與LPS處理的細(xì)胞質(zhì)中的p-p65結(jié)合,并且結(jié)合被Co-IPIB進(jìn)一步證實(shí)。本研究還證實(shí)內(nèi)化的DRD2可以促進(jìn)TAB1β-arrestin2的結(jié)合,并削弱TAB1TAK1的結(jié)合最重要的是,DRD2 激活的 β-arrestin2 通過(guò)與TAB1 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來(lái)拮抗TAK1的磷酸化。


DRD2通過(guò)下調(diào)DDX5eEF1A2抑制NF-κB通路激活和腫瘤發(fā)生

異位 DRD2表達(dá)顯著抑制p65 NF-κB 靶基因IL-10mRNA表達(dá),表明在沒(méi)有配體激活的情況下,DRD2NF-κB通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子。除了結(jié)合激活 β-arrestin2,DRD2 還可能以其他方式抑制 NF-κB 信號(hào)。為了研究機(jī)制,通過(guò) Co-IP 結(jié)合MS分析來(lái)鑒定結(jié)合蛋白質(zhì)。在MDA-MB231BT549細(xì)胞的所有結(jié)合蛋白中,DDX5、eEF1A2ICAM-1都被證實(shí)被異位DRD2表達(dá)下調(diào)。DDX5EEF1A2有幾種癌癥型號(hào)的癌基因。WB也證實(shí)了DDX5eEF1A2 的下調(diào)蛋白水平。在293TMDA-MB231中,通過(guò) Co-IP IB 測(cè)定證實(shí)了DRD2、DDX5eEF1A2 的結(jié)合,表明這三種蛋白質(zhì)形成了復(fù)合物。還揭示了293T MDA-MB231 DDX5p50之間的結(jié)合。此外,據(jù)報(bào)道,DRD2 與神經(jīng)系統(tǒng)中的 EGFR 結(jié)合。在BrCa細(xì)胞中,DRD2EGFR的結(jié)合也在293TMDA-MB231中得到證實(shí)。并且DRD2表達(dá)下調(diào)ERBB1EGFR)和ERBB2HER2)表達(dá),它們也是 NF-κB 的靶基因。而在DRD2過(guò)表達(dá)的BrCa細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn) DDX5促進(jìn) IκBαp65的磷酸化。eEF1A2被證明可以直接強(qiáng)烈增加p-p65而不影響IKKα/βIκBα,并且 eEF1A2在表達(dá) DRD2 MDA-MB231 中甚至在沒(méi)有 LPS 的情況下上調(diào)p-p65 的蛋白質(zhì)水平。上述結(jié)果表明,DRD2過(guò)表達(dá)抑制了 DDX5 eEF1A2 對(duì)促進(jìn) NF-κB 信號(hào)激活影響顯著。上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí) DRD2 抑制 NF-κB 信號(hào)激活并通過(guò)下調(diào) BrCa 細(xì)胞中的 DDX5 eEF1A2 發(fā)揮腫瘤抑制作用。