鐵死亡誘導Ca2+通量和ESCRT-III激活來調節(jié)細胞死亡動力學

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2021-08-13
目前有作者研究了不同細胞模型中Erastin-1和RSL3引發(fā)的Ferroptosis中質膜滲透的分子機制。利用活細胞成像和流式細胞......

 

鐵死亡(Ferroptosis)是一種不依賴caspase的調控細胞壞死形式,其特征是在細胞膜上產生鐵依賴的脂質過氧化物。Ferroptosis發(fā)生的一個基本步驟是破壞質膜。然而,導致Ferroptosis質膜完整性喪失的分子機制以及膜損傷的性質和大小尚未得到深入研究。其他形式的細胞死亡如壞死、焦亡或毒素誘導的細胞死亡會導致離子通量的激活。在這些情況下,Ca2+通量與膜修復機制的激活有關,同時轉運體(ESCRT)發(fā)揮了關鍵的平衡作用,可以延緩壞死和焦亡癥中的細胞死亡。目前有作者研究了不同細胞模型中Erastin-1RSL3引發(fā)的Ferroptosis中質膜滲透的分子機制。利用活細胞成像和流式細胞術,跟蹤了Ferroptosis不同特征的動力學。該研究發(fā)表于20213月《Cell Death & Differentiation》期刊上,IF:10.717。


技術路線:



主要結果如下:

1. 細胞內Ca2+持續(xù)增加是ferroptosis的標志

胞漿Ca2+增加、細胞腫脹以及質膜破裂被認為是壞死和焦亡的標志。為了評估這些細胞改變是否也發(fā)生在ferroptosis期間,作者通過活細胞共聚焦成像(1A-B)和流式細胞術(1C-H)檢測了用Erastin-1RSL3處理的小鼠成纖維細胞(NIH-3T3)的胞漿Ca2+水平,同時檢測了細胞形態(tài)和質膜破裂的變化。作者使用fluo-4am作為Ca2+指示劑的熒光形式,以可視化細胞內Ca2+水平,并使用熒光DNA插入劑PI作為不可逆質膜破壞和細胞死亡的標記。結果發(fā)現(xiàn)在使用Erastin-1RSL3處理后,NIH-3T3細胞胞質Ca2+濃度明顯增加(1A, B)。胞漿內Ca2+增加、細胞圓化和質膜破裂可被ferroptosis特異性抑制劑ferrostatin-1fer1)抑制(1A-F)。


1 Ferroptosis伴隨著細胞內Ca2+增加和細胞死亡


2.
脂質氧化先于胞質Ca2+的增加和質膜的破壞

體積細胞實驗中Ferroptosis特征之間的詳細時間關系被治療后群體細胞發(fā)生Ferroptosis的異質性所掩蓋。為了解決這個問題,作者使用活細胞共聚焦顯微鏡在單細胞水平上量化了Fluo-4 AM信號、細胞圓度和PI攝入量的增加。從單個細胞獲得的動力學曲線(2C, F, K)中,計算出每個ferroptotic表型(t50)實現(xiàn)50%變化所需的時間,這使得可以設置Ferroptosis各過程之間的滯后時間(2D, G, L)。結果發(fā)現(xiàn),與所使用的Ferroptosis觸發(fā)器無關,胞漿Ca2+的增加先于細胞圓縮和質膜完全坍塌(2A, B)。從流式細胞術實驗(1G)可以看出,Erastin-1存在時,胞質Ca2+的增加是一個雙相行為的兩步過程(2C)。第一個事件在最大Ca2+信號的40%左右達到飽和,與不相關的鈣(Ca2+un)增加相對應,因為它沒有受到Ferroptosis的抑制(1G)。第二次Ca2+升高,與RSL3處理常見,并被Fer-1抑制,對應的是針對鐵下垂的胞質Ca2+增加(Ca2+sp) (2F)。在Erastin-1處理后,Ca2+un增加,隨后Ca2+sp上升,細胞周圍和最終的PI攝入(2C-E)。相比之下,RSL3處理的細胞具有獨特和特定的Ca2+上升,隨后細胞圓整和最終的PI攝入(2F-H)。通過脂質過氧化傳感器C11 BODIPY 581/591觀察到RSL3處理促進了質膜和亞細胞膜上的脂質過氧化(圖2I),脂質過氧化先于細胞圓化(2J, K)??紤]到胞質Ca2+增加到細胞圓化之間的滯后時間始終低于脂質過氧化到細胞圓化之間的滯后時間,可以估計Ca2+的增加發(fā)生在脂質過氧化之后(2M)。這一估計是基于fluo- 4am(2F-H)BODIPY氧化比(2K, L)的獨立動力學之間的推斷。


2 在質膜破裂之前,胞質Ca2+和脂質氧化增加


3.
滲透活性劑保護細胞防止ferroptosis

氣孔形成是不同類型調控細胞死亡的共同特征。質膜孔的打開導致水分子的流入,這是由于無法通過膜孔的高濃度細胞內大分子造成的滲透失衡的結果(3A)。這種效果可以通過添加不能夠通過孔進入細胞的適當大小的滲透保護劑peg來阻止,從而平衡細胞內滲透壓、水流入和隨后的細胞坍塌(3B)。加入1.8?nmpeg并不能阻止胞質Ca2+的增加、細胞圓化或細胞死亡(3C-F)。相比之下,在peg(2.3nm2.7nm)的存在下,胞質Ca2+水平的增加和細胞死亡均以尺寸依賴的方式延遲(3D, F)。PEG(2.7nm)ferroptosis的保護作用在洗滌后恢復,這表明膜損傷隨時間的推移是穩(wěn)定的(3G)。我們還發(fā)現(xiàn),PEG(2.7nm)并不能阻止RSL3處理的NIH-3T3細胞的脂質過氧化(3H, I)。對于使用的所有PEG大小,NIH-3T3細胞處理較長時間(24 h)后細胞死亡恢復(3J)PEGferroptosis動力學的抑制作用也隨著RSL3濃度的增加而降低(3K, L)。最終作者以在較低濃度RSL3下能夠起到保護作用的PEG尺寸作為參考,得出質膜穿孔部分的半徑約為2.5 nm(3L)。

3 大尺寸的PEGferroptosis有滲透保護作用


4. ESCRT-III
復合物在
ferroptosis期間被激活,并拮抗細胞死亡

在壞死和焦亡過程中,依賴于ESCRT-III復合物作用的膜修復可以延緩細胞死亡。作者使用CHMP4B斑點形成作為代替ESCRT-III激活。最初,CHMP4B主要表現(xiàn)為均勻的胞質分布,然而,在RSL3處理后,該蛋白定位于不同的點狀結構,隨著時間的推移,其數(shù)量和熒光強度都在增加(4A, B)CHMP4B點的形成大致與胞質Ca2+濃度的增加相一致(4C, E)。當細胞修復機制最終被淹沒時,細胞內Ca2+水平持續(xù)升高、細胞圓化和ESCRT-III復合體激活后,細胞膜最終破裂(4B, E, F)PEG(2.7nm)處理也阻斷了CHMP4B斑點的形成 (4G-J)。這些結果證明了ESCRT-III復合物以Ca2+依賴的方式被激活來修復膜損傷。

為了研究ESCRT-IIIferroptosis中的功能作用,作者評估了抑制CHMP4BNIH-3T3細胞死亡的影響(5A, B)。與對照組相比,CHMP4B敲除細胞的死亡發(fā)生率更高、更快,特別是在早期時間點(1-3 h),這表明CHMP4B的缺失導致細胞對ferroptosis的敏感性更高。另外,作者使用蛋白質組譜儀XL細胞因子陣列試劑盒(5C),確定ferroptosis是否可以直接調節(jié)不同細胞系和不同處理下的細胞因子分泌。在誘導ferroptosis時,作者檢測到細胞因子亞群水平的變化,這些變化與細胞系和治療有關。此外,敲除CHMP4B改變了RSL3處理后獲得的細胞因子譜(5C, D)。這些結果表明,盡管具體的細胞因子改變依賴于治療,但ESCRT-III通常影響ferroptotic細胞的細胞因子分泌。另外,RSL3處理的沉默CHMP4B細胞的上清能夠增加小鼠巨噬細胞的CD14表面表達(5E)。這些結果表明,與壞死和焦亡相似,ESCRT-III也調節(jié)ferroptotic細胞的免疫輸出。


4 膜損傷與CHMP4B活化有關

 

5 ESCRT-III調節(jié)細胞死亡和嗜鐵細胞的免疫結果


結論:

ESCRT-IIIferroptosis微環(huán)境中調節(jié)細胞因子水平,揭示了這一機制在調控ferroptosis炎癥的作用。這些發(fā)現(xiàn)支持了一個普遍的模型,在這個模型中,質膜孔的形成和膜修復是控制不同類型的壞死及其炎癥特征的中心和相反的調控機制。


參考文獻:

Pedrera L, Espiritu RA, Ros U, Weber J, Schmitt A, Stroh J, Hailfinger S, von Karstedt S, García-Sáez AJ. Ferroptotic pores induce Ca2+ fluxes and ESCRT-III activation to modulate cell death kinetics. Cell Death Differ. 2021, 28(5):1644-1657. doi: 10.1038/s41418-020-00691-x