細胞周期蛋白依賴性激酶4和6(CDK4/6)的藥理學(xué)抑制劑是激素受體陽性乳腺癌的獲批治療藥物,目前正在其他癌癥類型的數(shù)百項臨床試驗中進行評價。這些抑制劑的臨床成功在很大程度上歸因于定義明確的腫瘤內(nèi)在細胞抑制機制,而其作為免疫調(diào)節(jié)劑的新作用知之甚少。本研究利用整合的表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析,證明了CDK4/6抑制劑在促進免疫T細胞記憶的表型和功能獲得中的新作用。本文的機制見解拓寬了CDK4/6抑制劑作為增強抗腫瘤T細胞免疫的臨床工具的前瞻性效用。本研究于2021年5月14日發(fā)表在《Cancer Discovery》IF:29.497期刊上。
技術(shù)路線:
主要實驗結(jié)果:
1、在響應(yīng)CDK4/6抑制中瘤內(nèi)記憶類CD8+ T細胞的表現(xiàn)
為了全面評價CDK4/6抑制對抗腫瘤T細胞免疫的影響,使用多模式單細胞測序(CITE-seq)分析了CDK4/6抑制劑palbociclib或?qū)φ仗幚淼?/span>MC38-OVA腫瘤小鼠的瘤內(nèi)T細胞群體 (Fig. 1A)。維度分析顯示MC38-OVA腫瘤中有10個不同的T細胞群(Fig. 1B)。用CDK4/6i處理的腫瘤有較低頻率的CD4+調(diào)節(jié)性T細胞(Foxp3+ Tregs),而CD8+記憶類T細胞頻率更高,以Tcf7、Sell、Bcl2和Cd7高表達為特征(Fig. 1B-D)。CD8+ T細胞池的基因動態(tài)表達揭示來源于CDK4/6i處理的小鼠的CD8+腫瘤免疫浸潤(TILs)向更早、更像干細胞的分化狀態(tài)傾斜(Fig. 1E-F)。與此一致,較早出現(xiàn)假時間軌跡的細胞表達更高水平的記憶相關(guān)基因(Tcf7, Sell, Il7r),和更低水平的效應(yīng)相關(guān)基因(Prf1, Gzmb)和耗損標志物(PD-1, TIM3) (Fig. 1G)。支持了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,流式細胞術(shù)表明帶有中央記憶(Tcm)表型(CD44+CD62L+)的CD8+ TILs的比例顯著更高,這在不同的腫瘤模型中是一致的(Fig. 1H)。為了檢驗抑制CDK4/6對抗腫瘤T細胞免疫的長期功能效應(yīng),用CDK4/6i在短時間 (抗腫瘤T細胞反應(yīng)最活躍的3-13天)處理MC38-OVA荷瘤小鼠,然后停藥。在停止治療時,CDK4/6i處理小鼠和對照小鼠的腫瘤體積是相等的(Fig. 1I-J)。引人注目的是,在停止治療后,既往使用CDK4/6i治療的小鼠中有21只小鼠腫瘤完全清除,而對照組只有9只(Fig. 1K)??傊@些數(shù)據(jù)表明CDK4/6的藥理抑制促進T細胞記憶,并產(chǎn)生能夠驅(qū)動有效和持續(xù)的抗腫瘤反應(yīng)的瘤內(nèi)T細胞室。
圖1用CDK4/6抑制劑處理的小鼠出現(xiàn)瘤內(nèi)記憶類CD8+ T的細胞。
2、CDK4/6i介導(dǎo)的CD8+ T細胞記憶獲得是細胞固有的
為了確定在CDK4/6i處理的腫瘤中觀察到的T細胞記憶是否由于CDK4/6在這些細胞內(nèi)的直接抑制,在體外將活化的小鼠CD8+ T細胞暴露于CDK4/6i中,并監(jiān)測Tcm獲取和分裂數(shù)。激活CDK4/6i暴露0、24、72 h后,Tcm細胞平均分裂數(shù)減少,同時細胞比例增加,且呈劑量依賴性,僅在24 h內(nèi)發(fā)生(Fig. 2A)。這表明CDK4/6i不是簡單地抑制分化,而是直接促進記憶形成,表明細胞周期機制與分化之間存在方向性關(guān)系。通過3'RNA-seq進一步分析發(fā)現(xiàn),在CDK4/6i處理后,記憶相關(guān)轉(zhuǎn)錄本增加,GSEA分析證實了記憶相關(guān)特征的富集,以及細胞周期相關(guān)特征的減少,包括E2F靶點(Fig. 2B-E)。矛盾的是,CDK4/6抑制也誘導(dǎo)了效應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄本,包括Gzma、Gzmc和Pdcd1 (Fig. 2B-C),這與之前CDK4/6i促進T細胞活化的報道一致。
基序分析發(fā)現(xiàn)E2F TF基序在乙酰化降低相關(guān)區(qū)域顯著富集,在T細胞記憶驅(qū)動因子相關(guān)基序乙酰化增加,包括含叉頭框因子(Fig. 2F)。為了確定這些變化是否伴隨著對不同細胞狀態(tài)的長期表觀遺傳影響,在CDK4/6抑制后對體外活化的T細胞進行了ATAC-seq,觀察到染色質(zhì)開放性的整體降低,T細胞記憶相關(guān)基因區(qū)域的開放性增加,包括Tcf7、Ccr7和Sell (Fig. 2G)。為了解開CDK4/6抑制后記憶和效應(yīng)特征的明顯二分法,在暴露于CDK4/6i 24h后,對體外活化T細胞進行了單細胞RNA-seq。該分析顯示存在CDK4/6i處理后改變的不同T細胞亞群,簇2、4、5和8增加,簇0減少,以及整體G1細胞周期停滯(Fig. 2H-I)。接下來對記憶和效應(yīng)基因標記,并使用AUCell比較富集評分,確定細胞池中不同的記憶樣和效應(yīng)樣簇(Fig. 2J)。有趣的是,CDK4/6i處理后增加的細胞簇2和5是記憶樣細胞,8是效應(yīng)樣細胞,證明CDK4/6i抑制促進異質(zhì)T細胞池中表型不同的亞群細胞的記憶分化,增強效應(yīng)功能。
圖2 CDK4/6i介導(dǎo)的CD8+ T細胞記憶獲得是細胞固有的
3、CDK4/6抑制劑促進記憶形成通過RB介導(dǎo)的G1停滯
為了確定驅(qū)動CDK4/6i誘導(dǎo)的記憶,對調(diào)節(jié)記憶標記的基因CD62L (SELL),進行了全基因組CRISPR/Cas9篩選,用基因組范圍的sgRNA文庫轉(zhuǎn)導(dǎo)表達Cas9的Jurkat T細胞(CDK4/6抑制后上調(diào)CD62L),然后用CDK4/6i處理,并對未能上調(diào)CD62L的細胞進行熒光激活細胞分選(Fig. 3A)。對分選群體進行測序發(fā)現(xiàn),靶向RB轉(zhuǎn)錄共抑制因子1(RB1)的sgRNA僅在處理條件下顯著富集(Fig. 3B),暗示RB是CDK4/6i誘導(dǎo)CD62L上調(diào)所必須的。隨后對急性(2h)暴露于CDK4/6i后的Jurkat細胞和活化的原代小鼠CD8 + T細胞進行了整體磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析(Fig. 3C)。在Jurkat和小鼠T細胞中檢測到多個肽上特異性磷酸化位點的顯著缺失,包括典型的CDK4/6靶標RB和RBL 1/2 (Fig. 3D-F)。值得注意的是,RB在兩種細胞蛋白組學(xué)中重疊,并且是全基因組CRISPR/Cas9篩選最顯著的(Fig. 3B,3G),表明CDK4/6i介導(dǎo)的記憶形成是由RB介導(dǎo)。因此,靶向敲除RB1,可以消除CD62L的表達上調(diào)(Fig. 3H)。3’RNA-seq分析顯示RB缺失廢除了轉(zhuǎn)錄對CDK4/6i的響應(yīng),包括SELL,其被CDK4/6i誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄改變被RB缺失所大幅度減弱了(Fig. 3I)。與此一致,靶向敲除RB1也廢除了激活的初級小鼠CD8+T細胞的Tcm形成(Fig. 3J)。
為了確定CDK4 /6i誘導(dǎo)的記憶形成是否通過細胞周期的RB介導(dǎo)的G1期阻滯,用G1阻滯劑處理細胞,胸腺嘧啶,通過阻止DNA合成和進入S期,獨立于RB的誘導(dǎo)G1阻滯。結(jié)果顯示胸腺嘧啶處理的細胞表型復(fù)制了CDK4/6抑制,并在很大程度上挽救了Rb1 KO細胞中Tcm的形成(Fig. 3J) ,表明RB介導(dǎo)的G1阻滯本身有助于CDK4 /6i誘導(dǎo)的記憶分化。通過3'RNA-seq進一步分析Rb1 KO細胞,發(fā)現(xiàn)記憶相關(guān)基因下調(diào)和效應(yīng)標記增加(圖3K-L),CDK4/6抑制后未能逆轉(zhuǎn)(圖3M-N)。這些結(jié)果表明CDK4/6i介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄重編程和記憶形成是通過RB依賴的G1細胞周期停滯和同時抑制CDK4/6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
圖3 CDK4/6抑制劑促進記憶形成通過RB
4、CDK4/6預(yù)處理增強功能性記憶CD8+ T細胞的持久性
長期生存能力是T細胞記憶的基本特征。為了確定CDK4/6i處理的細胞在體內(nèi)是否表現(xiàn)出優(yōu)越的存活率,將未處理和CDK4/6i預(yù)處理的體外活化CD45.1 OT-i T細胞轉(zhuǎn)移至同源CD45.2小鼠中,并通過流式細胞術(shù)評價其隨時間的持續(xù)性和表型(Fig. 4A)。在30天內(nèi),在血液和脾臟中檢測到的預(yù)處理OT-I - T細胞的頻率明顯更高(Fig. 4B)。30天后,未處理和預(yù)處理的OT-I - T細胞在血液和脾臟中的表型持久性相似,都具有記憶前體的特征 (MPECs; KLRG1-CD127+) (Fig. 4C)。為了評價CDK4/6i處理細胞的記憶能力,將未處理或體外活化的CD45.1 OT-i T細胞中預(yù)處理的細胞再次轉(zhuǎn)移至同源CD45.2宿主中。30d后,分離出OT-ⅠT細胞,等量重新轉(zhuǎn)移到同時感染李斯特菌-OVA(LM-OVA)的新宿主中(Fig. 4D)。未處理和預(yù)處理的OT-I T細胞在LM-OVA感染后擴增和分化,迅速獲得功能性、產(chǎn)生細胞因子的SLEC表型(KLRG1 + CD127-)(Fig. 4E-F)。這些表明CDK4/6抑制驅(qū)動T細胞記憶的表型和功能獲得。
然后使用單細胞RNA-seq來描述移植后30天脾臟中存留的T細胞的轉(zhuǎn)錄譜(Fig. 4G)。使用pseudobulk RNA-seq分析和預(yù)轉(zhuǎn)移體外培養(yǎng)的基因比較,生成了持續(xù)細胞的基因標記,其標志是記憶相關(guān)基因(Sell,Foxp1,Tcf7,Cd7,Il7r,Klf2,Ccl5)的高表達和效應(yīng)相關(guān)基因(Gzmd,Ifng,Prf1,Gzma,Gzmb)的低表達(Fig. 4H-I)。對先前的體外單細胞數(shù)據(jù)(Fig. 2H-J)的進一步分析顯示,CDK4/6i處理后,具有這種持續(xù)性特征的細胞頻率從7.5%增加至26.8%(Fig. 4J-K)。這些數(shù)據(jù)表明,抑制CDK4/6促進T細胞向真實的記憶表型分化,其特征是功能的長期持久性。
圖4CDK4/6預(yù)處理增強功能性記憶CD8+ T細胞的持久性
5、CDK4/6預(yù)處理增強CAR-T細胞的持久性和有效性
接下來測試CDK4/6i處理是否會誘導(dǎo)嵌合抗原受體(CAR)-T細胞的記憶表型,并克服CAR-T細胞治療成功的兩大障礙:T細胞耗竭和缺乏持久性。通過臨床試驗,以Lewis Y (LeY)抗原為靶點,制造了人類CAR-T細胞 (Fig. 5A)并發(fā)現(xiàn)暴露于CDK4/6i產(chǎn)生CD4+和CD8+干細胞記憶(Tscm)CAR-T細胞 (Fig. 5B)。CAR-T細胞的3’RNA-seq揭示CDK4/6抑制后記憶表達顯著改變,GSEA分析證實了記憶相對效應(yīng)信號的富集,并如預(yù)期E2F靶基因下調(diào) (Fig. 5C)。為了檢測在體內(nèi)的持久性,使用兩個獨立供體的PBMC生成的LeY CAR-T細胞用CDK4/6i預(yù)處理,并轉(zhuǎn)移到NSG小鼠中(Fig. 5D)。與未經(jīng)處理的對照組相比,觀察到在移植后的幾周內(nèi),血液中CD8+和CD4+預(yù)處理的CAR-T細胞的頻率和數(shù)量顯著增加(Fig. 5E-F)。為了評估這些CAR-T細胞的功能性記憶能力,在CAR-T細胞轉(zhuǎn)移后30天用LeY + 卵巢癌細胞系OVCAR-3(Fig. 5D)處理小鼠,觀察到與未處理的CAR組相比,預(yù)處理的CAR-T細胞在小鼠血液中的擴增顯著增加(Fig. 5G)。意味著先前接受過CAR-T細胞治療的小鼠的腫瘤控制顯著增強(Fig. 5H-I)。值得注意的是,第30天的腫瘤大小與腫瘤侵襲前血液中CD3+ T細胞的數(shù)量呈顯著負相關(guān)(Fig. 5J),表明CDK4/6i處理的CAR-T細胞的持久性增強是驅(qū)動腫瘤控制的關(guān)鍵因素。事實上,腫瘤接種后40天,接受預(yù)處理的CAR-T細胞的小鼠浸潤CD4+和CD8+ CAR-T細胞的數(shù)量顯著增加(Fig. 5K)。接下來通過將未處理或預(yù)處理的抗LeY CAR-T細胞轉(zhuǎn)移到OVCAR-3荷瘤小鼠體內(nèi),檢測了CDK4/6i預(yù)處理對CAR-T細胞急性療效的影響。用CDK4/6i預(yù)處理CAR-T細胞可顯著增強其抗腫瘤活性(Fig.5L-M)。與此一致,轉(zhuǎn)移后數(shù)周發(fā)現(xiàn)接受預(yù)處理細胞的小鼠血液中CD4 + 和CD8 + 細胞以及腫瘤中CD8 + 細胞數(shù)量顯著增高(Fig.5N-O)??傊?,這些數(shù)據(jù)證明CDK4/6i體外治療是增強CAR-T細胞表型和長期療效的穩(wěn)健策略。
圖5 CDK4/6預(yù)處理增強CAR-T細胞的持久性和有效性
6、CDK4/6抑制誘導(dǎo)T細胞表型與免疫檢查點封鎖的良好反應(yīng)相關(guān)
在臨床小鼠模型中,CDK4/6抑制劑與ICB顯示出顯著的協(xié)同作用。鑒于最近的研究強調(diào)腫瘤微環(huán)境中的干細胞樣T細胞是ICB反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì),作者假設(shè)CDK4/6i介導(dǎo)的T細胞記憶誘導(dǎo)產(chǎn)生了更有利的T細胞池用于免疫檢查點靶向治療,因此將有助于該聯(lián)合治療的療效。事實上,這種CDK4/6i應(yīng)答特征富集在ICB應(yīng)答患者的CD8 + TIL中,在單細胞和患者水平準確分為應(yīng)答者和非應(yīng)答者(Fig.6A-D)。這表明CDK4/6i誘導(dǎo)了T細胞內(nèi)基因特征,該特征與患者對ICB的良好反應(yīng)相關(guān)。
作者收集并分析了黑色素瘤患者在治療過程中的連續(xù)血液樣本,在此期間,患者接受CDK4/6i聯(lián)合靶向MEK抑制劑治療,隨后接受PD-1和CTLA-4 ICB聯(lián)合治療(Fig.6 F),患者達到完全緩解。使用CITE-seq技術(shù)評估一系列患者樣本,觀察到CDK4/6i + MEKi治療后CD8 + T細胞記憶群的頻率呈時間依賴性增加,其特征為SELL、IL7R和TCF7的高表達(Fig.6G-I),這與臨床分析一致。事實上,偽時間分析揭示了從記憶樣群體到效應(yīng)細胞的分化軌跡,CDK4/6i在該軌跡早期抑制CD8 + T細胞,隨后的ICB治療加速了分化(Fig.6J)。跨越該時間的TCR克隆追蹤也發(fā)現(xiàn),CDK4/6抑制增加了罕見T細胞克隆的頻率,主要存在于記憶群體內(nèi),隨后ICB處理擴增了這些克隆(Fig.6K)。這表明ICB治療釋放了外周血中更多種類T細胞受體??傊@些數(shù)據(jù)表明,CDK4/6i可用作ICB給藥前促進更有利T細胞表型的啟動工具。
圖6 CDK4/6抑制誘導(dǎo)ICB響應(yīng)T細胞表型
這項研究證明了在細胞毒性T細胞中藥理學(xué)抑制CDK4/6可誘導(dǎo)RB介導(dǎo)的G1期阻滯,并促進記憶表型的獲得,可顯著增強這些細胞的長期抗腫瘤活性(Fig. 7)。
圖7 CD8+ T細胞CDK4/6抑制劑的免疫增強效應(yīng)模型
參考文獻:
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